李云龍 黃炳哲 李正偉 樸成東

0 引言

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)可以表達(dá)成骨因子和血管生長因子，對于成骨的形成有著重要作用[1]。學(xué)者們對BMSCs等干預(yù)治療骨質(zhì)疏松進(jìn)行了大量的研究[2-8]，這些研究結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松動物通過BMSCs干預(yù)后，有利于成骨的形成。張澤華[9]以甲狀旁腺激素(parathyroid，PTH)聯(lián)合BMSCs干預(yù)大鼠骨質(zhì)疏松后對大鼠骨組織形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)PTH聯(lián)合BMSCs干預(yù)骨質(zhì)疏松動物的效果比以PTH 單獨(dú)干預(yù)骨質(zhì)疏松動物的效果好。Uejima等[10]將BMSCs移植到骨質(zhì)疏松模型大鼠的髓腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMSCs移植大鼠的髓腔內(nèi)后，骨密度得到了明顯提高，骨的抗彎曲力學(xué)性能也有明顯提高。Piao等[11]以BMSCs等干預(yù)骨質(zhì)疏松動物后對其骨應(yīng)力松弛、蠕變黏彈性特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BMSCs干預(yù)可以改善骨質(zhì)疏松大鼠的骨骼質(zhì)量，恢復(fù)骨的黏彈性。

骨質(zhì)疏松癥的最主要臨床并發(fā)癥是以骨量丟失易好發(fā)骨折為表現(xiàn)形式，從生物力學(xué)角度分析，骨折是由于骨骼的抗剪切和沖擊等力學(xué)性能降低所致。雷洛昔芬是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的常用藥品，對治療骨質(zhì)疏松具有一定的作用。對于以BMSCs、雷洛昔芬干預(yù)治療骨質(zhì)疏松后的剪切、沖擊強(qiáng)度等力學(xué)性能是臨床上醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)之一。目前以BMSCs、雷洛昔芬干預(yù)治療動物骨質(zhì)疏松后，采用剪切、沖擊力學(xué)性能指標(biāo)判斷治療效果罕見報道。作者提出這樣的假設(shè)：骨質(zhì)疏松后可能造成動物成骨細(xì)胞骨形成功能失衡，會使動物骨的抗剪切、沖擊力學(xué)性能指標(biāo)發(fā)生改變，骨質(zhì)疏松模型動物通過以BMSCs、雷洛昔芬干預(yù)后，其抗剪切、沖擊力學(xué)性能可能會得到一定的恢復(fù)。為驗(yàn)證此假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)選擇雷洛昔芬和BMSCs干預(yù)骨質(zhì)疏松動物模型對比分析其治療效果。實(shí)驗(yàn)分別以BMSCs、雷洛昔芬進(jìn)行干預(yù)治療骨質(zhì)疏松大鼠后，取動物骨進(jìn)行剪切、沖擊實(shí)驗(yàn)和骨密度測試，取大鼠血清進(jìn)行生物學(xué)指標(biāo)測試，以骨的剪切、沖擊、骨密度指標(biāo)和血清生物學(xué)指標(biāo)研判以BMSCs、雷洛昔芬干預(yù)治療治療骨質(zhì)疏松的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

6月齡雌性SD大鼠88只，體質(zhì)量241～246 g，由吉林大學(xué)新民校區(qū)動物實(shí)驗(yàn)中心(吉林長春)提供。隨機(jī)分為骨質(zhì)疏松動物模型組22只，正常對照組22只，骨質(zhì)疏松動物模型以雷洛昔芬干預(yù)組22只，骨質(zhì)疏松動物模型以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)組22只。本實(shí)驗(yàn)得到吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 骨質(zhì)疏松大鼠模型及其干預(yù)治療

以摘除大鼠卵巢法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型。首先將大鼠置于無菌環(huán)境下的動物手術(shù)床上，以2%的戊巴比妥鈉注射液2 mL/kg 注射到大鼠的腹腔，對大鼠進(jìn)行麻醉；之后在大鼠腹部正中部縱向切2.5 cm切口，逐層切入大鼠腹腔，沿著輸卵管找到大鼠的卵巢，結(jié)扎輸卵管后切除雙側(cè)卵巢。為預(yù)防感染，術(shù)后將105U 青霉素注入大鼠腹腔。骨密度(bone mineral density，BMD)是判斷骨質(zhì)疏的重要指標(biāo)，為判斷骨質(zhì)疏松動物模型是否造模成功，于建模6周后隨機(jī)取對照組和模型組10只大鼠L4椎骨，以美國明維思MindwaysQCT骨密度測量系統(tǒng)(美國得克薩斯州奧斯汀)測定其骨密度。結(jié)果表明，對照組骨密度為(171.8±8.2)mg/cm3，模型組骨密度為(131.4.±13.8)mg/cm3,模型組大鼠脛骨骨密度顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明骨質(zhì)疏松動物模型復(fù)制成功。

建模4周后，對BMSCs干預(yù)組大鼠通過尾靜脈一次性注射大鼠BMSCs 3 × 106個(美國Sciencell公司，美國加利福尼亞州圣地亞哥)。對雷洛昔芬干預(yù)組大鼠喂服雷洛昔芬(武漢江民華泰醫(yī)藥化工有限公司，中國武漢)。具體步驟：雷洛昔芬1片(60 mg)搗碎后投放到蒸餾水(60 mL)中制成濃度為 1 mg/mL藥液。按照動物與人體表面積換算公式計算給藥劑量(人體質(zhì)量設(shè)為65 kg，大鼠體質(zhì)量設(shè)為250 g)，雷洛昔芬干預(yù)組按照6.42 mg/(kg·d)每日早、晚各一次灌胃，連續(xù)給藥42 d。

1.2.2 樣本采集及實(shí)驗(yàn)步驟

對各組大鼠在給藥42 d后行剪尾采血，每只大鼠采血20 mL,將采集的血樣在空氣中靜置900 s之后以鑫中大離心機(jī)有限公司生產(chǎn)的XZD型低速離心機(jī)以2000 r/min的速度對血樣離心20 min，取上清置于-20℃環(huán)境下存放。然后分別將每只大鼠置于動物手術(shù)床上，將準(zhǔn)備好的2% 戊巴比妥鈉注射液2 mL/kg 注射到大鼠的腹腔，麻醉后以斷頭法處死大鼠。取大鼠肱骨做骨密度測試，取大鼠股骨待做沖擊實(shí)驗(yàn)，取大鼠脛骨做剪切實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 大鼠骨試樣包埋固定與幾何尺寸測量

大鼠骨試樣存放24 h后，取出各組大鼠脛骨、股骨試樣，以日本奧林巴斯株式會社(日本東京)生產(chǎn)的STM7型測量顯微鏡測量各組試樣的長度和直徑。試樣的長度為2.97～32.19 mm，試樣的直徑為1.87～1.99 mm。分別將每個脛骨和股骨的兩端置于深度為5.5 mm、外徑為9 mm、內(nèi)徑為4 mm的鋼制模具后馬上向模具中填充以牙托水稀釋的牙托粉，待固化后脫模，取出試樣。

1.2.4 檢測指標(biāo)

(1)生物學(xué)指標(biāo)包括血清Ca、P、血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)。以庫貝爾生物科技有限公司(廣東深圳)生產(chǎn)的iChem-530型全自動生化分析儀化驗(yàn)血清ALP、P、Ca。

(2)肱骨BMD測量：從每組右側(cè)肱骨中隨機(jī)取10個，以MindwaysQCT骨密度測量系統(tǒng)測定肱骨骨密度。

(3)剪切實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)備為深圳萬測實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司(廣東深圳)生產(chǎn)的WANCHE電子萬能試驗(yàn)機(jī)。隨機(jī)取各組大鼠脛骨各10個試樣，按參考文獻(xiàn)[12-14]所述的方法分別對每個脛骨試樣進(jìn)行處理預(yù)調(diào)后，將試樣分別裝入脛骨剪切實(shí)驗(yàn)夾具內(nèi)，放在試驗(yàn)機(jī)工作臺上。驅(qū)動試驗(yàn)機(jī)以1 mm/min的實(shí)驗(yàn)速度通過夾具對脛骨試樣進(jìn)行剪切試驗(yàn)，試樣破壞后，通過計算機(jī)獲得剪切實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(4)沖擊實(shí)驗(yàn)：小型沖擊試驗(yàn)機(jī)為萊比錫試驗(yàn)儀器廠(德國萊比錫市)生產(chǎn)。隨機(jī)取各組大鼠股骨各10個試樣，按參考文獻(xiàn)[12-14]所述的方法分別對每個股骨進(jìn)行處理預(yù)調(diào)后，放在機(jī)器的支座上, 擺起試驗(yàn)機(jī)的擺錘后釋放擺錘,將試樣沖斷, 測出每個試樣的沖擊功和沖擊韌性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果及分析

2.1 各組大鼠P、ALP、Ca、BMD測量結(jié)果

各組大鼠P、ALP、Ca、BMD測量結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠P、ALP、Ca、BMD測量結(jié)果(n=10)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對照組BMD、Ca、ALP值大于以AMSCs組(P<0.05)，其血清P小于AMSCs干預(yù)組(P<0.05)。AMSCs干預(yù)組BMD、Ca、ALP值大于雷洛昔芬干預(yù)組, 其血清P小于雷洛昔芬干預(yù)組(P<0.05)。以雷洛昔芬干預(yù)組BMD、Ca、ALP值大于模型組, 其血清P小于模型組(P<0.05)，說明以AMSCs干預(yù)后，具有提高骨質(zhì)疏松動物血清Ca、ALP、BMD，降低血清P的作用，有利于骨質(zhì)疏松動物骨質(zhì)的恢復(fù)。

2.2 各組大鼠脛骨剪切實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠脛骨剪切實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠脛骨剪切實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組最大載荷、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變小于對照組、AMSCs組、雷洛昔芬干預(yù)組(P<0.05),AMSCs干預(yù)組最大載荷、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變值大于模型組、以雷洛昔芬干預(yù)組(P<0.05)。說明以AMSCs干預(yù)后，具有提高骨質(zhì)疏松動物脛骨的剪切強(qiáng)度的作用。

2.3 各組大鼠股骨沖擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠股骨沖擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠股骨沖擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組沖擊功、沖擊韌性值小于對照組、AMSCs干預(yù)組、雷洛昔芬干預(yù)組(P<0.05), AMSCs干預(yù)組沖擊功、沖擊韌性值大于雷洛昔芬干預(yù)組(P<0.05)。說明以AMSCs干預(yù)后，具有提高骨質(zhì)疏松動物股骨的沖擊韌性的作用。

3 討論

血清Ca的測定對骨礦代謝和鈣磷代謝的研究具有重要價值[15]。血清P在骨礦物質(zhì)中的作用之一是維持機(jī)械強(qiáng)度，ALP是反映成骨細(xì)胞的重要標(biāo)志[16]。BMD是評價骨強(qiáng)度的基本指標(biāo)[17]。骨質(zhì)疏松大鼠通過以BMSCs干預(yù)治療后，可起到恢復(fù)Ca、ALP、BMD值，提高骨量促進(jìn)骨形成的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠骨的力學(xué)性能和BMD、血清Ca、血清ALP具有一定的關(guān)系，BMD、血清Ca、血清ALP恢復(fù)得越好，骨的剪切、沖擊力學(xué)性能恢復(fù)得越好。

各組大鼠脛骨剪切實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脛骨剪切實(shí)驗(yàn)試樣破壞斷口多數(shù)為橫斷口，少數(shù)為斜斷口。模型組大鼠脛骨的剪切力學(xué)性能發(fā)生了改變。各組大鼠股骨沖擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，股骨沖擊試樣破壞斷口多數(shù)為粉碎性斷口,與臨床暴力損傷造成的粉碎性骨折相似。模型組大鼠股骨的沖擊力學(xué)性能發(fā)生了改變。

骨生物力學(xué)是反映骨生長代謝情況的一個重要指標(biāo)，是骨量、骨結(jié)構(gòu)連續(xù)性、骨皮質(zhì)厚度及骨的材料特性的綜合指標(biāo)。當(dāng)骨的柔韌性減小，脆性增高，骨發(fā)生為骨折的概率相應(yīng)增大[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松動物模型通過以AMSCs干預(yù)治療后改善了骨的結(jié)構(gòu)，提高了骨的強(qiáng)度和韌性，與所期望的結(jié)果相符。

Wang 等[19]以切除新西蘭家兔卵巢的方法復(fù)制骨質(zhì)疏松動物模型，體外將新西蘭白兔的BMSCs與藻酸鈣凝膠混合，注入骨質(zhì)疏松新西蘭家兔股骨的遠(yuǎn)端，移植 8 周后進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和骨組織力學(xué)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單純注射藻酸鈣凝膠相比，MSCs-藻酸鈣凝膠實(shí)驗(yàn)組在注射處理的局部組織處具有更多的骨組織，骨小梁密度增加，骨的拉力強(qiáng)度提高，這就證實(shí) BMSC 對局部骨質(zhì)疏松骨具有強(qiáng)化作用。Piao等[20]以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)骨質(zhì)疏松動物后對大鼠股骨進(jìn)行應(yīng)力松弛、蠕變生物力學(xué)等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)組7 200 s應(yīng)力下降量大于模型組和阿侖膦酸鈉干預(yù)組(P<0.05)，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)組7 200 s應(yīng)變上升量大于模型組和以阿侖膦酸鈉干預(yù)組(P<0.05)。因此得出以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后，骨質(zhì)得到了一定的改善，其黏彈性力學(xué)特性得到一定的恢復(fù)的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)與參考文獻(xiàn)Wang 等[19]、Piao等[20]研究不同的是，本實(shí)驗(yàn)以剪切、沖擊生物力學(xué)指標(biāo)和骨密度等生物學(xué)指標(biāo)判斷以BMSCs干預(yù)骨質(zhì)疏松大鼠的效果,具有創(chuàng)新性。

Piao等[21]以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與阿侖膦酸鈉干預(yù)骨質(zhì)疏松大鼠后對大鼠股骨進(jìn)行壓縮等實(shí)驗(yàn)和骨密度、骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)指標(biāo)測量，結(jié)果表明以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、阿侖膦酸鈉干預(yù)，可使骨質(zhì)疏松動物的代謝功能和骨的強(qiáng)度、韌性得到一定的提高。本實(shí)驗(yàn)是前期工作的連續(xù)，目的是系統(tǒng)研究以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等干預(yù)治療骨質(zhì)疏松動物，以血清生物學(xué)指標(biāo)和動物骨的剪切、沖擊力學(xué)指標(biāo)判斷骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等干預(yù)治療骨質(zhì)疏松動物的效果，為骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供生物學(xué)和生物力學(xué)基礎(chǔ)。

Ocarino 等[22]，將體外分離培養(yǎng)的同種異體BMSCs注入去勢大鼠股骨,研究發(fā)現(xiàn)大鼠骨小梁表面綠色熒光蛋白陽性，ALT、膠原合成及礦化結(jié)節(jié)明顯增高,而骨質(zhì)疏松的大鼠其BMMSCs分化能力明顯較健康對照組減弱；組織形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)大鼠股骨的骨量明顯得到改善，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對于骨質(zhì)疏松癥的治愈具有非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和參考文獻(xiàn)[22]的結(jié)果表現(xiàn)出良好的一致性。

4 結(jié)論

骨質(zhì)疏松動物模型通過以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后，血清生物學(xué)指標(biāo)Ca、ALP、骨密度指標(biāo)和骨的強(qiáng)度和韌性可以得到一定的恢復(fù)。