常賀翠

膀胱癌是我國(guó)人群泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與病死率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[1-3]。術(shù)后采用抗腫瘤藥物膀胱灌注治療可在一定程度上降低術(shù)后癌癥的復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后。然而灌注化療方案的個(gè)體化選擇較困難，容易出現(xiàn)耐藥等情況[4-6]。因此，選用敏感的化療藥物進(jìn)行個(gè)體化治療是提高療效的關(guān)鍵。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 選擇2014年1月-2016年1月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的膀胱癌患者的腫瘤組織標(biāo)本60例(新的腫瘤組織標(biāo)本，取材前患者均未接受放化療)，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)為膀胱癌，根據(jù)治療方法不同分為藥敏組35例和對(duì)照組25例。藥敏組男25例，女10例；年齡(58.4±1.6)歲；分期：pTa 22例，pT1 13例；病理分級(jí)：C15例，C218例，C312例。對(duì)照組男18例，女7例；年齡(50.9±2.1)歲；分期：pTa 8例，pT1 17例；病理分級(jí)：C16例，C25例，C314例。藥敏組取材后即刻進(jìn)行ATP-生物熒光法(ATP-TCA)檢測(cè)[7]。藥敏組化療方案取決于藥敏試驗(yàn)，對(duì)照組根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)制定化療方案，2組均隨訪2年。

1.2 藥物與儀器 4種化療藥物分別為：表柔比星(EPI，浙江海正醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，10 mg/支)、吉西他濱(GEM，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，0.2 g/支)、絲裂霉素(MMC，浙江海正醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，2 mg/支)、吡柔比星(THP，浙江海正醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，10 mg/支)。儀器：細(xì)胞培養(yǎng)板，微孔板熒光分析儀(Berthord公司生產(chǎn))，ATP-TCA試劑盒(浙江海創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn))包括完全培養(yǎng)基、ATP抽提劑、腫瘤組織消化酶、熒光素—熒光素酶、稀釋緩沖液、ATP標(biāo)準(zhǔn)液，藥物儲(chǔ)存液(用0.9%氯化鈉溶液或葡萄糖溶液配制)-20 ℃分裝保存。

1.3 體外藥敏試驗(yàn) 在無(wú)菌條件下，于30 min內(nèi)用75%乙醇清洗新鮮的腫瘤組織標(biāo)本，并將標(biāo)本組織剪成約1 mm3的小塊，將消化酶加入腫瘤組織，在37 ℃的培養(yǎng)箱中消化2 h，每隔20 min混合1次。將溶液倒入200目的篩網(wǎng)中過濾，離心5 min，棄上清液，將紅細(xì)胞裂解液加入過濾后的溶液里，繼續(xù)離心5 min，用CAM重懸制成細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，并調(diào)細(xì)胞懸液使細(xì)胞濃度為(1～3)×105個(gè)/ml。藥物試驗(yàn)濃度參考各藥物常用臨床劑量所對(duì)應(yīng)的血漿峰值濃度(PPC)：THP 1 mg/ml、EPI 1 mg/ml、GEM 5 mg/ml、MMC 0.34 mg/ml。將化療藥物置于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，按倍比依次稀釋至5個(gè)梯度藥物濃度(200%～12.5%)，每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)定M0為無(wú)藥對(duì)照孔，MI為空白孔，只有200 μl完全培養(yǎng)基，作為檢測(cè)背景值。分別在5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將腫瘤細(xì)胞ATP抽提劑(30 μl)加入微孔板內(nèi)，混勻，加入熒光素酶工作液40 μl到各個(gè)檢測(cè)孔，1 min后置入熒光檢測(cè)儀中逐列進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用微孔板熒光分析儀計(jì)算各藥物濃度梯度的細(xì)胞抑制率、抑制50%腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度(IC50)和抑制90%腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度(IC90)。將藥物對(duì)腫瘤的影響分為：敏感：IC50≤25%PPC；輕度敏感：IC90≤100%PPC且IC50>25%PPC，或Index≤300；耐藥：IC90>100%PPC且IC50>25%PPC且Index>300。敏感率=敏感例數(shù)/(敏感例數(shù)+耐藥例數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱癌標(biāo)本的可評(píng)價(jià)率 藥敏組35例膀胱癌標(biāo)本均成功進(jìn)行了4種藥物的敏感性測(cè)定，可評(píng)價(jià)率為100.0%(35/35)。

2.2 藥敏組患者化療藥物的敏感性和耐藥性 4種化療藥物中，單種藥物的敏感率為THP>MMC>GEM>EPI。THP的敏感率明顯高于GEM、EPI(P<0.01)，MMC的敏感率高于GEM和EPI(P<0.05)。見表1。

表1 藥敏組35例膀胱癌細(xì)胞對(duì)化療藥物體外敏感性

2.3 遠(yuǎn)期療效 2年的醫(yī)學(xué)隨訪期內(nèi)，藥敏組患者腫瘤復(fù)發(fā)率低于對(duì)照組，2年生存率高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者遠(yuǎn)期療效比較 [例(%)]

3 討 論

膀胱灌注在預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)方面起著重要作用[8-9]。但由于腫瘤異質(zhì)性(形態(tài)異質(zhì)性、基因異質(zhì)性和功能異質(zhì)性)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性存在個(gè)體差異[10]，治療過程中普遍發(fā)生腫瘤多藥耐藥，原發(fā)或繼發(fā)性耐藥導(dǎo)致部分患者化療失敗，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11-12]，嚴(yán)重影響腫瘤化療成效[13]。

個(gè)體化治療是腫瘤化療成功的關(guān)鍵，腫瘤的藥敏試驗(yàn)在個(gè)體化化療中具有重要意義。近年來(lái)，各種體外化療藥物敏感試驗(yàn)為臨床治療腫瘤提供了越來(lái)越多的依據(jù)，使個(gè)體化治療的成功率大大提高，其中ATP-TCA法具有敏感、迅速、療效高的特點(diǎn)。研究顯示，ATP-TCA法在指導(dǎo)個(gè)體化治療的肺癌患者中取得了良好的臨床應(yīng)用價(jià)值，但ATP-TCA法在乳腺癌、消化道腫瘤及膀胱癌個(gè)體化用藥中的應(yīng)用較少，數(shù)據(jù)不夠，此法尚處于初步階段[14]，還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

本研究結(jié)果顯示，藥敏組標(biāo)本的可評(píng)估率為100.0%，藥敏組35例標(biāo)本中，敏感率較高的化療藥物依次為THP(77.1%)>MMC(62.9%)>GEM(25.7%)>EPI(8.6%)，與GEM、EPI比較，THP和MCC敏感率明顯增加。因此，臨床應(yīng)用化療藥物時(shí)要慎重使用GEM和EPI，THP和MMC可在一線化療方案中考慮使用。此外，對(duì)2組患者隨訪2年，結(jié)果顯示，藥敏組膀胱癌2年復(fù)發(fā)率為14.3%，明顯低于對(duì)照組的36.0%，且藥敏組患者2年生存率85.7%，高于對(duì)照組的64.0%，提示基于ATP-TCA法個(gè)體化化療對(duì)提高膀胱癌患者遠(yuǎn)期療效具有一定指導(dǎo)意義。

由于本研究涉及的樣本量有限，研究周期較短，納入的藥物種類少，導(dǎo)致研究結(jié)果可能存在偏倚。因此，下一步研究擬擴(kuò)大樣本量，并增加其他常用化療藥物，特別是小分子靶向藥物，增加患者隨訪研究時(shí)間，以期為提高患者化療療效、減少耐藥性、減輕化療不良反應(yīng)對(duì)機(jī)體的影響、減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、降低膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)率，進(jìn)一步提高膀胱癌患者的生活質(zhì)量及生存率提供臨床依據(jù)。