王穎，張?jiān)?，袁海潑，劉娟，彭騰，龔光明

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

2型糖尿病是以血糖升高為主要特征的機(jī)體代謝紊亂的慢性病，其患病率占糖尿病的90%以上［1］。隨著生活方式的改變，其發(fā)病呈逐年上升趨勢。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)管理2型糖尿病主要以控制血糖及降低遠(yuǎn)期并發(fā)癥為主，從而改善患者病情，以期提高生活質(zhì)量。西藥雖能迅速控制血糖水平，卻仍然不能阻止并發(fā)癥的出現(xiàn)。因此，需要研究新的藥物來解決目前面臨的難題。2型糖尿病隸屬中醫(yī)“消渴病”范疇，病機(jī)以陰虛燥熱為主，治療以益氣養(yǎng)陰，清熱生津?yàn)橹鳎?］。中醫(yī)藥治療消渴由來已久且臨床療效顯著，運(yùn)用中醫(yī)整體論治及治未病的理論，對中藥治療2型糖尿病進(jìn)行深入研究并有效地開發(fā)刻不容緩。

黃精屬百合科黃精、多花黃精、滇黃精干燥的根莖，味甘、性平，主入肺、脾、腎三經(jīng)，能補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎，多用于治療陰虛肺燥、干咳少痰、肺腎陰虛、勞嗽久咳［3］。現(xiàn)廣泛應(yīng)用于臨床治療消渴病，成為眾多中藥復(fù)方的成分之一。黃精的活性成分主要包括黃精多糖、皂苷、黃酮、氨基酸、醌類化合物、木脂素等。以上成分不僅在保護(hù)肝臟、心血管系統(tǒng)，抗腫瘤等諸多疾病防治方面發(fā)揮很大的效能，而且還具有調(diào)節(jié)免疫，降血糖、調(diào)血脂的作用［4－6］。近年來，多項(xiàng)研究證實(shí)，黃精在控制血糖方面具有較好的療效［7－9］。李友元等［10］在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，黃精多糖可以通過糖基化損傷，改善胰島功能，降低糖尿病模型小鼠的血糖和糖化血紅蛋白水平。趙宏麗［11］研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖可調(diào)節(jié)肝臟SREBP－1c和SCD－1蛋白的表達(dá)起到改善糖代謝的作用。鑒于黃精在基礎(chǔ)和臨床研究中都顯示出明確的降糖作用，但未能系統(tǒng)地闡述該藥物的有效活性成分、體內(nèi)作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。本研究擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析黃精治療2型糖尿病的潛在效應(yīng)靶點(diǎn)及通路，為臨床治療糖尿病提供藥理學(xué)基礎(chǔ)和新的方向。

1 方法

1.1 黃精活性成分及靶點(diǎn)的篩選進(jìn)入TCMSP數(shù)據(jù)庫網(wǎng)頁（http：／／ibts.hkbu.edu.hk／LSP／tcmsp.php）檢索中藥黃精的拼音，對出現(xiàn)的所有藥物活性成分按OB＞30%和DL＞0.18進(jìn)行過濾，得出黃精藥效成分和成分靶點(diǎn)。運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：／／www.uniprot.org／），得到成分與靶點(diǎn)對應(yīng)的關(guān)系。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選本次研究主要使用Gene Cards數(shù)據(jù)庫（http：／／www.genecards.org／）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https：／／omim.org／），輸入“T2DM”“type 2 diabetes”檢索出與該病相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析通過篩選出的藥物活性成分、靶點(diǎn)及疾病的靶點(diǎn)，繪制出藥物成分－靶點(diǎn)－疾病三者相互作用的關(guān)系。利用韋恩圖（Venn diagram）繪制藥物成分與疾病的共有靶點(diǎn)；通過Cytoscape軟件3.7.2版（http：／／www.cytoscape.org／）繪制成分－靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)；再將疾病成分共有的靶點(diǎn)導(dǎo)入String：functional protein association networks數(shù)據(jù)庫Multiple proteins工具中，將物種來源限定為人類，得出蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖及相應(yīng)的TSV格式的文件；將molist，type，network文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，再進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥Ｗ詈髮ⅫS精干預(yù)2型糖尿病的靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，得出2型糖尿?。S精－靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 黃精活性成分篩選結(jié)果通過限定OB及DL篩選出黃精的候選活性成分12種，主要以皂苷和多糖類為主，另外還含有蒽醌類、氨基酸等化合物。見表1。

表1 黃精活性成分篩選表

2.2 候選成分靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果通過搜索黃精得出成分靶點(diǎn)共515個(gè)，再運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：／／www.uniprot.org／），得到成分與靶點(diǎn)對應(yīng)的關(guān)系108對，刪除重復(fù)后剩余68個(gè)成分靶點(diǎn)。

2.3 2型糖尿病靶點(diǎn)預(yù)測在GeneCards和OMIM兩大數(shù)據(jù)庫中檢索疾病名稱，得出與2型糖尿病有關(guān)的靶點(diǎn)13 181個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后剩余13 094個(gè)，將此作為該病的候選靶點(diǎn)基因。

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

2.4.1 藥物－成分－靶點(diǎn)－疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將得到的藥物活性成分，靶點(diǎn)及成分－靶點(diǎn)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，選擇網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)、邊等基本屬性，得出藥物－成分－靶點(diǎn)－疾病網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1）。該網(wǎng)絡(luò)總計(jì)節(jié)點(diǎn)72個(gè)，邊176條，網(wǎng)絡(luò)平均相鄰節(jié)點(diǎn)4.730。其中8個(gè)節(jié)點(diǎn)代表黃精的有效成分，64個(gè)節(jié)點(diǎn)代表與藥效成分效應(yīng)的疾病靶點(diǎn)。

圖1 藥物－成分－靶點(diǎn)－疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.2 疾病靶點(diǎn)作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖 通過VENE圖（見圖2）得出黃精活性成分與2型糖尿病共有64個(gè)靶點(diǎn)，然后導(dǎo)入String：functional protein association networks數(shù)據(jù)庫，設(shè)定不顯示離散的靶點(diǎn)，得出疾病靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。再根據(jù)蛋白與蛋白之間的關(guān)聯(lián)性大小進(jìn)行排序，得出排名在前20的靶點(diǎn)（見圖4）。

圖2 VENE圖

2.4.3 GO功能富集分析 通過對中藥黃精的活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，可以得出被富集了87個(gè)條目，取相關(guān)性較大的前20個(gè)功能富集以柱狀圖形式表示（見圖5），P值代表富集的顯著性。這些靶點(diǎn)基因在生物學(xué)層面顯示出主要參與細(xì)胞的代謝、增殖，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，氧化應(yīng)激，蛋白水解，受體激活等生物過程。在細(xì)胞層面這些靶點(diǎn)主要與細(xì)胞核DNA、RNA的轉(zhuǎn)錄，血色素結(jié)合等功能相關(guān)等。在分子層面這類靶點(diǎn)基因與蛋白質(zhì)結(jié)合，蛋白激酶活性，神經(jīng)遞質(zhì)活性，類固醇激素受體活性等功能相關(guān)。

圖4 PPI靶點(diǎn)排序

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

2.4.4 KEGG通路富集分析 將黃精活性成分效應(yīng)的2型糖尿病的靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示該類基因總共富集在105條信號(hào)通路，取富集集中的前20個(gè)以柱狀圖顯示（見圖6）。富集的通路主要與病毒感染、癌癥通路、細(xì)胞凋亡、糖尿病及并發(fā)癥的AGE－RAGE信號(hào)通路、胰島素抵抗、IL－17信號(hào)通路、甲狀腺信號(hào)通路、性激素等密切相關(guān)。

圖6 KEGG通路富集分析柱狀圖

3 討論

圖1所展現(xiàn)的藥物－成分－靶點(diǎn)－疾病網(wǎng)絡(luò)中涉及黃精的活性成分8種，對應(yīng)的靶點(diǎn)64個(gè)。即有一種活性成分對應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，也有一個(gè)靶點(diǎn)對應(yīng)多種活性成分，這充分體現(xiàn)出中藥成分多元性及多靶點(diǎn)、多機(jī)制調(diào)控疾病的作用。圖2顯示出黃精活性成分和疾病的交集靶點(diǎn)。圖3是各個(gè)靶點(diǎn)交互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，顯示出黃精干預(yù)2型糖尿病各蛋白之間的相互作用，說明多基因共同作用導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。圖4是黃精干預(yù)2型糖尿病效應(yīng)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)性最緊密的前20位。圖5和圖6對其靶點(diǎn)的功能及通路進(jìn)行分析，表明黃精治療2型糖尿病可能是藥物多成分、多基因靶點(diǎn)、多通路等多重效應(yīng)機(jī)制共同作用的結(jié)果。AKT1、MAPK14、JUN、MTOR等基因與黃精干預(yù)2型糖尿病相關(guān)性最高。

2型糖尿病發(fā)病主要與胰島素抵抗有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)PI3K－AKT1蛋白磷酸化表達(dá)下降影響是導(dǎo)致胰島素抵抗的主要機(jī)制［12］。正常情況下胰島素與受體結(jié)合，其受體磷酸化介導(dǎo)其受體底物的酪氨酸磷酸化，再激活下游通路，將胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至效應(yīng)器發(fā)揮作用。當(dāng)胰島素受體底物發(fā)生磷酸化，且作用于絲氨酸、蘇氨酸，就會(huì)直接影響酪氨酸磷酸化過程，使胰島素受體與其相應(yīng)受體底物結(jié)合松散，并削弱激活下游底物PI3K的能力，從而使胰島素信號(hào)傳導(dǎo)較弱，誘發(fā)胰島素抵抗［13］。研究顯示，MAPK14基因參與介導(dǎo)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生［14］。干擾胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激酶包括JUN氨基末端激酶、MTOR（哺乳動(dòng)物西羅莫司靶蛋白）等激酶均能影響胰島素信號(hào)正常的發(fā)揮作用，引發(fā)胰島素抵抗［15］。綜上，這四種基因都與胰島素抵抗相關(guān)。因此，黃精可能通過調(diào)節(jié)以上靶點(diǎn)達(dá)到干預(yù)2型糖尿病的目的。

本研究是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究方法對黃精治療2型糖尿病的潛在機(jī)制進(jìn)行研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃精對降糖起效的主要有黃精多糖、皂苷、黃酮等。主要作用的靶點(diǎn)有AKT1、MAPK14、JUN、MTOR等，證實(shí)了黃精是通過多成分、多靶點(diǎn)，多通路干預(yù)2型糖尿病，這為臨床使用中藥治療2型糖尿病提供新的思路和一定的理論基礎(chǔ)。然而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要以數(shù)據(jù)整合為主，若數(shù)據(jù)的不完整則會(huì)直接影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，在今后的研究中若發(fā)現(xiàn)新的藥物成分和作用靶點(diǎn)，還需進(jìn)一步更新取證。