高曉娟，娜斯拜·阿卜杜瓦哈普，馬曉玲，王魯娟，王 飛，李江偉?

(1. 新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆烏魯木齊830046；2. 新疆優(yōu)邁生物技術(shù)有限公司，新疆 烏魯木齊830011 )

0 引言

蛋白質(zhì)作為生物體內(nèi)最重要的一類生物大分子物質(zhì)，因其具有特異性高、用藥劑量低、生理活性強等特點，目前被廣泛地作為藥物用于人類疾病治療．但由于分子量大、抗原性強、具有毒副作用多等缺點，限制了其在臨床上的使用[1,2]．因此大量小分子蛋白或基因工程肽類藥物相繼被開發(fā)應(yīng)用．然而，由于這些小分子蛋白或多肽分子尺寸減小，通常會迅速從體內(nèi)清除，導(dǎo)致其血漿半衰期縮短[3]．因此，通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)來提高蛋白藥物的體內(nèi)半衰期，已成為當今蛋白藥物研發(fā)的重點方向[4]．治療性應(yīng)用通常需要緩慢的藥物清除速率，以避免高劑量和頻繁給藥對病人帶來的生理上的病痛及經(jīng)濟上的負擔．目前已經(jīng)開發(fā)出各種方法來延長這些小分子蛋白在體內(nèi)的血漿半衰期．例如將聚乙二醇鏈與小分子蛋白進行化學(xué)偶聯(lián)，通過增大表觀分子量來提高其半衰期[5,6]．另一種改善小蛋白藥代動力學(xué)的方法是將蛋白質(zhì)與人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）進行基因融合[7,8]．融合后的重組蛋白分子量顯著增大，減少了腎小球的濾過作用．此外，當白蛋白被溶酶體吞噬時，由于新生兒Fc受體（FcRn）介導(dǎo)的再循環(huán)機制使其避免被降解的命運，進一步延長了融合蛋白的血漿半衰期[9]．目前HSA已成功地用于產(chǎn)生融合蛋白，例如與激素（胰島素、人類生長激素）[10,11]和細胞因子（干擾素-α、干擾素-β、IL-2）[12?14]結(jié)合，以調(diào)節(jié)藥代動力學(xué)特性，從而提高這些分子的治療效果．小分子蛋白藥物與白蛋白結(jié)合肽或結(jié)合域的基因融合是白蛋白基因融合的另一種選擇[15]．來源于鏈球菌G蛋白的白蛋白結(jié)構(gòu)域(Albumin Binding Domains，ABD)能夠與HSA緊密結(jié)合，改造后的ABD與HSA的親和力可達飛摩爾級[16]，短壽命的小分子蛋白通過與ABD進行基因融合，能夠顯著增強其半衰期．

CD47也稱整合素相關(guān)蛋白（integrin-associated protein，IAP），是一種細胞膜表面廣泛表達的五跨膜受體，屬于免疫球蛋白超家族．CD47與巨噬細胞表面的SIRPα結(jié)合，激活酪氨酸磷酸化酶，抑制肌球蛋白在巨噬細胞突觸膜下裝配位點的聚集，發(fā)出“別吃我”的信號，可以促使腫瘤細胞逃避巨噬細胞的吞噬作用[17,18]．目前已有大量研究表明CD47抗體對不同種的腫瘤細胞具有抑制作用，例如肝癌細胞系[19]、乳腺癌細胞系[20,21]、卵巢癌細胞系[22]、非霍奇金淋巴瘤細胞系[23]等．因此，可以預(yù)期CD47是一個新的、有前景的抗腫瘤靶點，在腫瘤免疫中的研究具有廣泛的前景．

當前，靶向CD47的抗體治療在多種腫瘤動物實驗中取得了令人鼓舞的效果[24,25]．我們在前期實驗中，制備獲得了抗CD47納米抗體（另文報道），但由于該納米抗體體內(nèi)半衰期短，不利于其體內(nèi)應(yīng)用．在本研究中，我們采用分子克隆手段，將抗CD47納米抗體與白蛋白結(jié)合域進行基因融合，獲得CD47-ABD融合蛋白，以期望其在具有本身生物活性的同時提高血漿半衰期，為解決納米抗體代謝時間短的問題提供一種有效的解決方案．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

限制性內(nèi)切酶（NcoI，XhoI）購自TaKaRa公司；重組子測序由生工生物工程（上海）公司完成；Plasmid mini kit質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；CD47重組蛋白購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；抗His-tag兔多克隆抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；抗HA-tag鼠單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG ，感受態(tài)大腸桿菌DH5α/BL21（DE3）均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光試劑盒來自碧云天公司；清潔級ICR雌性小鼠購于新疆醫(yī)科大學(xué)；抗CD47納米抗體表達載體pET22b-3D3-2為本實驗室保存．

1.2 融合ABD的CD47納米抗體3D3-2-ABD的克隆及表達純化

根據(jù)參考文獻[26]獲得ABD氨基酸序列，設(shè)計并合成3D3-2-ABD原核表達載體．ABD被設(shè)計融合至3D3-2的C末端，并且在ABD的C末端設(shè)計添加HA-tag便于后續(xù)檢測．重組表達載體pET22b-3D3-2-ABD交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成．

從轉(zhuǎn)化pET22b-3D3-2-ABD的菌株提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶NcoI 與XhoI 進行雙酶切驗證．將驗證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）中，隨機挑取單克隆37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8時，加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L，放置搖床上30 ℃、220 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h．分別取1 mL誘導(dǎo)前后的菌液離心收集沉淀重懸在1 X PBS中，加5 ×上樣緩沖液煮沸10 min，高速離心10 min后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，考馬斯亮藍染色檢測融合蛋白的表達．挑選高表達量的克隆菌株擴大培養(yǎng)，150 r/min，30 ℃恒溫過夜誘導(dǎo)培養(yǎng)．誘導(dǎo)表達后的菌液離心去除上清，1×PBS 洗滌后將所得菌體沉淀采用反復(fù)凍融及滲透休克法處理后收集上清液．上清液用0.45 μm 濾器過濾除雜后，使用Ni離子凝膠親和柱純化．收集各組分流出液，并用SDS-PAGE檢測純化后的蛋白質(zhì)．3D3-2蛋白純化操作同上．

1.3 Western blot驗證純化的3D3-2/3D3-2-ABD蛋白

將純化后的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，90 V恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜上．將PVDF膜用含5%脫脂奶粉的PBST（pH 7.4）于4 ℃封閉過夜．PBST 洗膜3次后，分別加入抗His-tag兔多克隆抗體( 1∶10 000稀釋)，抗HAtag鼠單克隆抗體( 1∶3 000稀釋)，37 ℃孵育2 h．PBST 洗膜3次，分別加入HRP標記的羊抗兔及羊抗鼠二抗( 1∶3 000稀釋)，37 ℃孵育1 h．PBST 洗膜5次，用增強型ECL底物顯色試劑盒顯色．

1.4 ELISA檢測3D3-2-ABD與CD47及HSA的結(jié)合

采用間接ELISA 方法對3D3-2/3D3-2-ABD 與CD47 抗原的結(jié)合親和力進行檢測，檢測方法如下：將抗原rhCD47以1 μg/mL的濃度在96孔板中4 ℃包被過夜．用含5%脫脂奶粉的PBS于37 ℃封閉2 h．PBST 洗板3次后分別加入不同濃度的3D3-2及3D3-2-ABD純化蛋白作為一抗，37 ℃孵育2 h．PBST 洗板3次后加入抗HA-tag鼠單克隆抗體( 1∶3 000稀釋)作為二抗37 ℃孵育1 h．PBST 洗板3次后加入HRP標記的羊抗鼠三抗（1∶5 000稀釋），37 ℃孵育1 h，PBST洗板6次后加入100 μL TMB 顯色液避光顯色5～15 min．加入50 μL 2 mol硫酸終止反應(yīng)，酶標儀檢測OD450的吸光值．

為驗證3D3-2-ABD與HSA 的結(jié)合能力，采用間接ELISA法進行檢測．檢測方法如下：將HSA 以1 μg/mL的濃度4 ℃包被過夜．用含5%脫脂奶粉的PBS于37 ℃封閉2 h．PBST洗板3次后加入不同濃度的3D3-2-ABD蛋白，37 ℃孵育2 h．PBST洗板3次后加入抗HA-tag鼠單克隆抗體( 1∶3 000稀釋)于37 ℃孵育1 h．PBST洗板3次后加入羊抗鼠-HRP（1∶5 000稀釋），37 ℃孵育1 h．PBST洗板6次后加入100 μL TMB 顯色液避光顯色5～15 min后加入50 μL 2 mol 硫酸終止反應(yīng)．酶標儀檢測OD450的吸光值．

1.5 融合蛋白標準曲線的建立

采用雙抗夾心ELISA的方法制作融合蛋白的標準曲線．使用抗HA-tag鼠單克隆抗體(1∶3 000稀釋)作為捕獲抗體，于4 ℃包被過夜．用5%脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h．PBST洗板3次后分別加入100 μL不同濃度（125、62.5、32、16、8、0 ng/μL）的3D3-2與3D3-2-ABD蛋白稀釋液，37 ℃孵育2 h．PBST洗板3次，加入檢測抗體抗His-tag兔多克隆抗體(1∶20 000稀釋)，37 ℃孵育1 h．PBST洗板3次后加入羊抗兔-HRP(1∶5 000 稀釋)，37 ℃孵育1 h．PBST洗板6次后加入100 μL TMB顯色液避光顯色5～15 min后加入50 μL 2 mol硫酸終止反應(yīng)．酶標儀檢測OD450的吸光值．以3D3-2/3D3-2-ABD融合蛋白濃度為自變量，OD450值為因變量，使用Excel制作融合蛋白的標準曲線．

1.6 3D3-2/3D3-2-ABD 的體內(nèi)代謝半衰期測定

取6只ICR雌性小鼠（30～35 g）隨機平均分為兩組，分別單次尾靜脈注射100 μg的3D3-2與3D3-2-ABD融合蛋白．在注射后的3，10，30，60，120，360 min 與6 d（3D3-2蛋白）及3，10，30，60，120，360 min，24 h 與6 d（3D3-2-ABD融合蛋白）對小鼠進行眼眶取血并分離血清．所得血清樣本稀釋100倍后，采用雙抗夾心ELISA的方法檢測血清中融合蛋白的濃度．血漿消除半衰期使藥物在體內(nèi)達到平衡后，血漿藥物濃度消除一半所需的時間．根據(jù)一級消除動力學(xué)消除時量曲線：t=(lnC0?lnC)/k，使用Excel計算出藥動學(xué)相關(guān)參數(shù)．

2 結(jié)果與分析

2.1 融合蛋白3D3-2-ABD表達載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達

重組表達載體pET22b-3D3-2-ABD的構(gòu)建策略及ABD氨基酸序列如圖1（A）所示．通過柔性連接linker將3D3-2及ABD進行基因融合，采用分子克隆技術(shù)進行構(gòu)建．將獲得的DH5α-pET22b-3D3-2-ABD菌液進行質(zhì)粒提取，使用限制性內(nèi)切酶NcoI與XhoI對提取的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖1（B）．瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，雙酶切后的質(zhì)粒顯示出明顯的兩條條帶．分子量大小約為5 000 bp的條帶為pET22b載體條帶，而另一條分子量大小約為600 bp的條帶為3D3-2-ABD片段條帶．

隨機挑取轉(zhuǎn)化后的BL21-pET22b-3D3-2-ABD菌落并進行小量誘導(dǎo)表達檢測，SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖1（C）所示．誘導(dǎo)后的菌液樣本在約27 kDa大小處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，其分子量大小與目的蛋白3D3-2-ABD的大小相符，該蛋白被成功誘導(dǎo)表達．

圖1 融合蛋白3D3-2-ABD表達載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達Fig 1 Construction and induction of fusion protein 3D3-2-ABD expression vector

2.2 融合蛋白3D3-2/3D3-2-ABD 的親和純化及Western blot驗證

挑取表達量高的菌株進行大量誘導(dǎo)并純化，將純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，蛋白膠經(jīng)考馬斯亮藍染色后顯示，分別在20 kD（3D3-2）及27 kDa（3D3-2-ABD）處出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，結(jié)果見圖2(A)．通過BCA蛋白定量法最終測得2 mg 的3D3-2 蛋白及2.2 mg 的3D3-2-ABD 純化蛋白．兩種融合蛋白的產(chǎn)率有所不同，3D3-2蛋白產(chǎn)率為7.5 mg/L，3D3-2-ABD蛋白產(chǎn)率為5.5 mg/L．之后對純化的蛋白進行Western blot檢測．因為3D3-2及3D3-2-ABD蛋白皆帶有HA-tag與His-tag標簽，因此WB檢測時分別使用Anti-HA（圖2(B)上半部分）及Anti-His（圖2(B)下半部分）的檢測抗體對純化的蛋白進行檢測．純化后的蛋白皆能被兩種抗體檢測到，進一步表明純化所得蛋白為目的蛋白．

圖2 融合蛋白3D3-2/3D3-2-ABD 的親和純化（A）及Western blot（B）驗證Fig 2 Affinity purification（A）and Western blot（B）verification of fusion protein 3D3-2/3D3-2-ABD

2.3 融合蛋白3D3-2-ABD與抗原結(jié)合活性

使用間接ELISA的方法檢測融合蛋白3D3-2及3D3-2-ABD與抗原CD47的結(jié)合活性．結(jié)果顯示，3D3-2與3D3-2-ABD都能夠與抗原CD47結(jié)合，見圖3．3D3-2及3D3-2-ABD 與抗原的結(jié)合程度隨著蛋白濃度的增加而增強，改造后的融合蛋白3D3-2-ABD與抗原的結(jié)合性較3D3-2相比有所下降．

圖3 3D3-2/3D3-2-ABD與rhCD47的結(jié)合活性測定Fig 3 Binding activity of 3D3-2/3D3-2-ABD and rhCD47

2.4 3D3-2-ABD與HSA的結(jié)合活性檢測結(jié)果

采用間接ELISA的方法檢測3D3-2-ABD與HSA的結(jié)合活性，結(jié)果見圖4．二者的結(jié)合強度隨3D3-2-ABD濃度的增加而增強，且在HSA包被濃度為1 μg/mL，3D3-2-ABD濃度為5 μg/mL時二者結(jié)合達到飽和．

圖4 3D3-2-ABD與HSA結(jié)合活性檢測結(jié)果Fig 4 Binding activity of 3D3-2-ABD and HSA

2.5 融合蛋白3D3-2/3D3-2-ABD血漿半衰期檢測的結(jié)果

對兩組小鼠分別尾靜脈注射相同劑量的3D3-2及3D3-2-ABD融合蛋白，通過ELISA測定不同時間點獲取的血清樣品中融合蛋白的濃度．如圖5所示，3D3-2蛋白在血液中快速清除，其終末半衰期（t1/2）為35.82 min．而3D3-2-ABD融合蛋白的代謝時間顯著延長，其終末半衰期為501.52 min，半衰期提升了約14倍．

圖5 不同時間點血清中融合蛋白的濃度Fig 5 Concentration of fusion protein in serum at different time points

3 討 論

納米抗體獨特的結(jié)構(gòu)使它具有不同于常規(guī)抗體的優(yōu)點：獨特的抗體決定簇能夠識別全長抗體難以識別的表位，分子質(zhì)量小、免疫原性弱、抗原結(jié)合能力及組織穿透力強等．雖然小分子的尺寸使得納米抗體的組織穿透能力優(yōu)于一般的常規(guī)抗體，但也不可避免的帶來了因為尺寸小而在生物體內(nèi)清除速率快的弊端．在臨床上為了達到治療效果，必須高頻率或高劑量給藥，這不僅給病人帶來身體上的痛苦和經(jīng)濟上的負擔，頻繁的給藥更會導(dǎo)致免疫原性問題．因此，通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)優(yōu)化蛋白結(jié)構(gòu)、化學(xué)修飾、基因融合等手段，提高蛋白藥物的體內(nèi)半衰期，已成為當今蛋白藥物研發(fā)的重點方向．

蛋白融合技術(shù)主要通過DNA重組技術(shù)，從基因水平改變原蛋白的基因序列，從而改變其生物功能，同時通過增加相對分子質(zhì)量降低腎清除率，以延長融合蛋白的半衰期．與PEG化學(xué)修飾的方法相比，蛋白融合技術(shù)操作更加簡便、靈活且高效．由于不需要進行化學(xué)修飾，產(chǎn)物均一易于純化，質(zhì)量控制也相對容易[27]，大大減少了人工及時間成本．

HSA是人體血漿的主要成分之一(含量達40 g/L)，其體內(nèi)半衰期長達19 d．將HSA作為融合伴侶，將其連接到半衰期較短的蛋白類藥物上，是研發(fā)長效蛋白藥物的重要途徑之一[28]．然而HSA分子量較大（66 kDa），將其與納米抗體融合極大地增加了納米抗體的尺寸，這必然會導(dǎo)致納米抗體失去其小尺寸所具有的獨特優(yōu)勢．一種來源于鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合域可以與多種物種的血清白蛋白緊密結(jié)合，如HSA．因此，選擇該結(jié)構(gòu)域作為融合伴侶，同樣可以提高短壽命蛋白的半衰期．Guo Rui[29]等人通過將該結(jié)合域與免疫毒素融合，使得融合蛋白的半衰期從原本的13.5 min延長至330.8 min，提高了約24.4倍的時長．基于此基礎(chǔ)，本實驗設(shè)計并開發(fā)了一種融合了白蛋白結(jié)合域的CD47納米抗體原核表達載體，并在大腸桿菌BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式在細胞上清液中大量表達．通過Ni+親和柱純化，獲得了較高純度及產(chǎn)率（5.5 mg/L）的CD47-ABD融合蛋白．并成功的使其半衰期從原本的35.82 min延長至了501.52 min，相當于約14倍的延長，血漿半衰期得到了極大的改善．與未改造前的CD47納米抗體相比，CD47-ABD與CD47抗原的結(jié)合活性稍有下降，這可能是由于ABD結(jié)構(gòu)域的引入導(dǎo)致融合蛋白在空間結(jié)構(gòu)上發(fā)生了改變，從而出現(xiàn)納米抗體上與抗原結(jié)合的位點被遮蔽的現(xiàn)象，導(dǎo)致融合蛋白的抗原結(jié)合活性受到了一定程度的影響．雖然融合蛋白的抗原結(jié)合活性與改造前相比在低劑量時稍有下降，但在高劑量時二者結(jié)合活性趨于相似，可以達到相似的治療效果．CD47-ABD融合蛋白同時擁有CD47及HSA兩個抗原結(jié)合位點，相當于一個雙特異抗體，其為研究雙特異抗體在抗腫瘤作用及延長半衰期作用相關(guān)問題上提供了一種新的思路．