羅云霞 余曦 田敏 鄧偲捷 呂紅彬

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病(DM)常見的微血管并發(fā)癥之一，是工作年齡人群第一位的致盲疾病[1]。DR的發(fā)生發(fā)展與組織缺血缺氧、新生血管形成密切相關，新生血管的形成可能導致玻璃體積血、牽拉性視網膜脫離，嚴重影響患者視功能[1]。目前DR發(fā)病機制尚不完全清楚。長期慢性高血糖、缺氧可誘導缺氧誘導因子1α(HIF-1α)產生，HIF-1α是新生血管形成過程中的關鍵因子，可刺激下游血管內皮生長因子(VEGF)等的表達，促進新生血管形成，加重DR缺血缺氧[2]。PI3K/Akt通路是誘導內皮細胞增殖和血管形成的關鍵信號通路[3]。叔丁基對苯二酚(tBHQ)是食品中常見的抗氧化添加劑，可通過激活核因子E2相關因子2(Nrf2) 與抗氧化反應元件(ARE)結合發(fā)揮抗氧化作用[4-5]。本實驗擬通過tBHQ干預2型DM大鼠，觀察干預后4周、12周和20周時大鼠空腹血糖、血脂及視網膜中PI3K、HIF-1α和VEGF的表達，探索tBHQ對2型DM大鼠視網膜的長期保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組健康雄性Sprague Dawley大鼠(6周齡左右，體質量160～180 g)90只，購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心。適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法抽取18只大鼠作為正常對照組(NC組)，其余72只作為造模組。NC組大鼠給予基礎飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)。4周后，造模組大鼠禁食12 h后腹腔注射30 mg·kg-1鏈脲佐菌素(STZ)，1周后尾靜脈采血，如血糖≥16.7 mmol·L-1視為造模成功，剔除造模失敗的4只大鼠，68只造模成功大鼠進一步隨機分為DM組34只及tBHQ組(34只)。DM組繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)，tBHQ組則于成模后1周喂養(yǎng)添加10 g·L-1tBHQ的高脂高糖飼料。去除飼養(yǎng)過程中死亡的大鼠后，最終NC組18只，DM組26只，tBHQ組29只。實驗動物的使用和管理遵守國家及西南醫(yī)科大學制定的實驗動物管理條例。

1.1.2 主要試劑及儀器STZ(美國Sigma公司)；tBHQ(比利時Acros公司)；總RNA 提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR Green染料(日本寶生物工程有限公司)；兔抗大鼠PI3K、HIF-1α多克隆抗體(美國 Abcom公司)；PI3K、HIF-1α、VEGF、GAPDH引物序列(上海生工生物工程有限公司)。血糖儀(德國羅氏公司)；qRT-PCR儀CFX96(美國BIO-RAD公司)；7180全自動生化分析儀(日本日立公司)；Leica生物顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 生化指標檢測及眼球標本制備分別于tBHQ干預后4周、12周和20周時，將3組大鼠禁食過夜后，采用10 g·L-1戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔內注射，待大鼠麻醉生效后行心臟穿刺采血，采用7180全自動生化分析儀測定各組大鼠血脂和空腹血糖。其中干預后4周、12周，每組各隨機選擇8只大鼠用于實驗；干預后20周，各組剩余大鼠全部用于實驗。心臟采血后處死各組大鼠，摘除雙眼眼球，其中一只眼球以40 g·L-1多聚甲醛溶液固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋后以5 μm連續(xù)切片；另一只眼球快速分離出大鼠視網膜，于PBS中漂洗后迅速放入無RNA酶的EP管中，立即于液氮中速凍后轉移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HE染色和免疫組織化學染色檢測各組大鼠眼球石蠟切片部分用于常規(guī)HE染色，中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察視網膜各層結構；部分用于標準免疫組織化學染色，采用兔抗大鼠PI3K和HIF-1α多克隆抗體作為一抗，加二抗后DAB顯色。免疫組織化學切片于高倍鏡下隨機選擇3個不同視野拍照，使用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析，以棕黃色或棕褐色著色者為陽性反應，測定單位面積的平均光密度值。

1.2.3 qRT-PCR檢測RNA提取試劑盒提取各組大鼠視網膜總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，采用SYBR Green實時熒光定量PCR法擴增cDNA。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；共40個循環(huán)。以GAPDH作為內參照，計算PI3K、HIF-1α、VEGF mRNA的相對表達量。引物序列如下：HIF-1α：正向引物為5’-GTGCTGATTTGTGAACCCATTC-3’，反向引物為5’- TCAACCCAGACATATCCACCTC-3’；VEGF：正向引物為5’- GCTACTGCCGTCCGATTGAG-3’，反向引物為5’-GGCTTTGTTCTGTCTTTCTTTGGT-3’；PI3K：正向引物為5’- CACGGCGATTACACTCTTACACT-3’，反向引物為5’- ATCCTGCTGGTATTTGGACACT-3’。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。三樣本均數(shù)比較，符合正態(tài)分布且方差齊者用方差檢驗，進一步兩兩比較用LSD法；方差不齊者行Welch方差分析。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況干預后4周、12周、20周，3組大鼠間空腹血糖水平總體差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。與同時間點NC組相比，DM組大鼠空腹血糖均明顯升高(均為P<0.05)；與同時間點DM組相比，tBHQ組大鼠空腹血糖均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。干預后4周、12周、20周，DM組大鼠空腹血糖水平總體差異具有統(tǒng)計學意義(F=49.323,P<0.01)，隨著造模時間延長，DM組大鼠空腹血糖呈升高趨勢。tBHQ組在不同時間點空腹血糖水平總體呈逐漸降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 3組大鼠不同時間點空腹血糖水平

2.2 各組大鼠血脂情況干預后4周、12周、20周，DM組、tBHQ組和NC組間TC、LDL-C水平比較差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)，DM組、tBHQ組TC、LDL-C水平均較NC組升高(均為P<0.01);干預后4周，tBHQ組TC、LDL-C水平與DM組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.109、0.581);干預后12周、20周，tBHQ組TC、LDL-C水平均較DM組降低(均為P<0.05)。隨著造模時間的延長，DM組大鼠TC水平呈升高趨勢(F=25.163,P<0.01)；tBHQ組在干預后不同時間點間TC水平差異無統(tǒng)計學意義(F=2.027,P=0.155)。干預后4周、12周、20周，DM組、tBHQ組和NC組間TG水平比較差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)；DM組TG水平均較NC組升高(均為P<0.01)；tBHQ組TG水平均較DM組降低(均為P<0.05)(見表2)。

表2 3組大鼠不同時間點血清中TC、TG和LDL-C變化情況

2.3 各組視網膜HE染色結果不同時間點NC組大鼠視網膜各層結構均清晰，細胞排列均整齊。干預后4周，DM組、tBHQ組大鼠視網膜各層排列稍紊亂。干預后12周，DM組、tBHQ組大鼠視網膜神經節(jié)細胞呈空泡樣改變，內叢狀層、外叢狀層排列紊亂、變薄，內核層、外核層細胞密度減少，排列稀疏，厚度變??；tBHQ組較DM組形態(tài)改變輕。干預后20周，DM組大鼠視網膜各層水腫，形態(tài)學改變較干預后12周更為明顯；tBHQ 組較DM組視網膜各層排列整齊，水腫不明顯(圖1)。

圖1 光學顯微鏡下不同時間點各組大鼠視網膜組織形態(tài)(HE染色,×400) A、B、C為干預后4周，D、E、F為干預后12周，G、H、I為干預后20周；A、D、G為NC組，B、E、H為DM組，C、F、I為tBHQ組。

2.4 各組大鼠視網膜PI3K和HIF-1α蛋白相對表達量PI3K主要表達于視網膜神經節(jié)細胞層，少部分表達于內核層，HIF-1α主要表達于視網膜神經節(jié)細胞層和內核層。干預后4周、12周、20周，NC組大鼠視網膜可見少量PI3K和HIF-1α蛋白的陽性表達，DM組、tBHQ組PI3K和HIF-1α蛋白的陽性表達量均顯著增加。3組大鼠在不同時間點視網膜中PI3K和HIF-1α蛋白相對表達水平總體差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。干預后不同時間點DM組、tBHQ組大鼠視網膜HIF-1α和PI3K蛋白相對表達量均較NC組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均

為P<0.05)。干預后12周、20周，tBHQ組HIF-1α和PI3K蛋白相對表達量均較DM組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。tBHQ組大鼠視網膜HIF-1α蛋白相對表達量隨時間增加呈下降趨勢(F=21.30,P<0.01)，PI3K蛋白相對表達量在不同時間點差異無統(tǒng)計學意義(F=0.226,P=0.802)。DM組大鼠視網膜PI3K蛋白相對表達量干預后20周均較干預后12周、4周增加，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)(見圖2)。

圖2 各組不同時間點視網膜PI3K、HIF-1α蛋白相對表達量 注：與同時間點NC組比較，*P<0.05；與同時間點DM組比較，#P<0.05。

2.5 3組大鼠視網膜中PI3K、HIF-1α和VEGF mRNA的表達干預后4周、12周、20周，3組大鼠間視網膜HIF-1α、VEGF和PI3K mRNA相對表達量總體差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。不同時間點DM組HIF-1α、VEGF、PI3K mRNA相對表達量均較同時間點NC組增加，tBHQ組均較同期DM組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(圖3)。DM組PI3K mRNA相對表達量隨時間的延長而增加(均為P<0.05)，VEGF和HIF-1α mRNA相對表達量在干預后20周均較干預后4周明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

圖3 qRT-PCR檢測3組大鼠視網膜中PI3K、HIF-1α、VEGF mRNA的相對表達量 注：與同時間點NC組比較，*P<0.05；與同時間點DM組比較，#P<0.05；與干預后4周時DM組比較，▲P<0.05；與干預后12周時DM組比較，△P<0.05。

3 討論

根據國際DM聯(lián)盟發(fā)布的第九版全球DM地圖，2019年DM年齡標化患病率為8.3%，預計2030年為9.2%，中國DM患者數(shù)量居世界之首[6]，有研究表明，35%的 DM患者伴隨有不同程度的DR[7]。發(fā)生DR的危險因素眾多，包括高血壓、高血糖、高血脂、高年齡和遺傳傾向等[8]。DR是DM常見的微血管并發(fā)癥之一，血-視網膜屏障破壞及新生血管形成是最終導致失明的主要原因[9]。tBHQ是食品中常用的抗氧化劑，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化和神經保護作用[10]。本實驗通過腹腔注射STZ并予以高脂高糖飲食成功誘導2型DM大鼠模型，DM組大鼠TC、TG和LDL-C水平均較NC組明顯升高。

前期研究表明，tBHQ通過激活Nrf2/ARE通路誘導一系列抗氧化作用[4-5]。但有研究表明，除Nrf2/ARE通路外，tBHQ還可通過PI3K/Akt信號通路對血管內皮細胞起保護作用[11]。Bahia等[12]研究表明，tBHQ可以激活PI3K/Akt信號通路，抑制FoxO3a的轉運和活性發(fā)揮神經保護作用。因此，值得進一步探索tBHQ對2型DM患者視網膜的保護機制及是否具有長期保護作用。

缺氧是導致DR至關重要的因素，在缺氧條件下，HIF-1α亞基與β亞基形成復合體異位到細胞核內與HIF反應元件結合，參與氧化應激、凋亡、新生血管形成等一系列反應[13]。STZ誘導的DM 大鼠胰島素分泌降低，組織對葡萄糖的攝取能力降低，加劇了視網膜的缺血缺氧。HIF-1α是機體適應氧濃度變化的主要轉錄因子，Zhang等[2]通過玻璃體內注射HIF-1α反義寡核苷酸發(fā)現(xiàn)，玻璃體內HIF-1α與VEGF表達呈現(xiàn)一致性，抑制HIF-1α可減輕視網膜新生血管形成，且HIF-1α表達隨DR病程延長而增加。本實驗中，DM組大鼠HIF-1α表達隨喂養(yǎng)時間的延長而有所增加，干預后4周、12周和20周，tBHQ組HIF-1α表達均較同時間點DM組下降，說明tBHQ可以通過抑制HIF-1α表達，抑制血管內皮細胞增殖、遷移，從而抑制視網膜新生血管形成。有研究表明，在高糖環(huán)境下，HIF-1α蛋白表達水平增加并增強其轉錄活性，刺激下游基因如VEGF等表達，促進新生血管形成[14]。HIF-1α也可以調節(jié)細胞葡萄糖攝取的葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)和GLUT3的表達，參與糖酵解過程的酶的表達，加重組織的缺血缺氧，再次刺激HIF-1α的表達[15]。本研究干預后不同時間點，tBHQ組大鼠血糖均較DM組明顯降低，且干預后20周時血糖較同時間點DM組降低幅度更大，說明tBHQ有一定的降低血糖作用，可能間接影響了視網膜組織中HIF-1α的表達，同時說明tBHQ對DM組大鼠視網膜具有長期保護作用。干預后20周時tBHQ組大鼠空腹血糖較同時間點NC組仍升高，說明tBHQ改善胰島素β細胞的功能具有一定局限性。

PI3K/Akt通路是誘導內皮細胞增殖和血管形成的關鍵信號通路[3]。Liu等[16]研究表明，在高糖環(huán)境下，PI3K/Akt通路對Nrf2表達的調控在細胞抗氧化和抗凋亡反應的調控中起重要作用。Paeng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下活性氧簇生成時，PI3K/Akt激活誘導VEGF生成的上游信號，使用活性氧抑制劑可顯著地抑制PI3K/AKT的激活，以及HIF-1α和VEGF的表達，這與本實驗結果部分一致。本實驗中，DM組視網膜PI3K表達較NC組增加，且隨著高糖狀態(tài)時間的延長，干預后20周較干預后12周和4周明顯升高，tBHQ組PI3K表達較DM組明顯降低，在干預后20周趨勢更加明顯。這說明tBHQ對2型DM大鼠視網膜起保護作用可能是通過抑制PI3K/Akt通路從而抑制HIF-1α/VEGF表達實現(xiàn)的。

綜上，本研究結果表明，tBHQ對2型DM大鼠視網膜具有較長的保護作用，且其機制可能是通過PI3K/HIF-1α/VEGF通路實現(xiàn)的。