林偉青 林飛 王海東

（江西省人民醫(yī)院 南昌330006）

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，而且近年來隨著我國工業(yè)化及環(huán)境污染日益嚴重，發(fā)病率和死亡率上升明顯，而且有低齡化的趨勢。Tu H等[1]和Vieira AR等[2]根據(jù)流行病學的調查研究發(fā)現(xiàn)，多食用蔬菜水果可明顯降低肺癌發(fā)生風險。近年來有許多有關中藥抑制腫瘤的研究報道[3～4]。鼠曲草又名白艾、佛耳草、清明菜，是一種藥食兩用野生植物，味甘、性平，歸肺經(jīng)，被廣泛用于各種疾病的治療和保健，在中國民間已有幾千年的使用歷史，進一步研究開發(fā)其藥用價值有著十分重要的意義。本研究嘗試通過動物實驗研究對比不同濃度鼠曲草提取液對大鼠肺癌形成是否存在抑制作用，初步探索鼠曲草對肺癌的預防機制?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取10～12周齡SPF級SD大鼠120只，體質量200～220 g，購自南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心。隨機分為對照組和高、中、低濃度組，每組30只。

1.2 試劑3,4-苯并芘購自美國Sigma公司；鼠曲草（Gnaphalium affine D.Don）購自南昌大學第一附屬醫(yī)院藥劑科中藥房；鼠曲草水提取液由江西省人民醫(yī)院制劑室自制，濃度分別為2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml；TUNEL試劑盒購自Roche公司。

1.3 研究方法

1.3.1 病理切片制備及觀察 所有SD大鼠在實驗室喂養(yǎng)1周以適應環(huán)境，灌注前以10%水合氯醛（100 mg/kg）行腹腔內注射麻醉，起效后取仰臥位固定，用細針經(jīng)右側胸廓中部穿刺至肺內，準確控制進針深度至針尖穿過胸壁入肺內2～3 mm處注入3,4-苯并芘玉米油混合溶液0.2 ml（含3,4-苯并芘2 mg），每周1次，共4次。對照組正常飲水，高、中、低劑量組分別以高、中、低濃度鼠曲草水提取液代水喂食，于第24周處死全部大鼠，取其肺組織標本，低溫生理鹽水洗凈，10%甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片4～5μm，行蘇木素-伊紅（HE）染色，置顯微鏡下觀察其病理變化。

1.3.2 原位末端轉移酶標記（TUNEL）法檢測癌細胞凋亡 具體步驟按說明書操作，切片按常規(guī)方法進行脫蠟，60℃烘片60 min后，用二甲苯脫蠟2次，乙醇水合作用（100%、95%、80%、75%）每次5 min；切片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min；樣本浸泡于pH 6.0的檸檬酸緩沖液中，微波中高火加熱8 min左右，自然晾涼。再將切片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min；配制3%H2O2封閉液：80 ml甲醇加入10 ml H2O和10 ml H2O2（30%），即用即配；樣本片浸入封閉液中，室溫（15～25℃）封閉10 min；樣本片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min；樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50μl TdT酶反應液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應60 min（注：陰性對照樣本不加TdT酶反應液）。反應后的樣本片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min，樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50μl Streptavidin-HRP工作液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應30 min；反應后的樣本片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min。樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50 μl DAB工作液，室溫顯色反應30 s～5 min，顯色后的樣本片浸入1×PBS漂洗3次，每次5 min。蘇木素、甲基綠等常規(guī)染液復染（自備試劑）：將樣本上滴加蘇木素染液，染色30 s～5 min（在顯微鏡下觀察確定），蒸餾水沖洗干凈后浸入1%鹽酸甲醇溶液中分化5 s，立即用蒸餾水沖洗干凈。分別用70%、85%、95%、無水乙醇浸洗5 min。用二甲苯浸2次，每次10 min。晾干后在切片上加中性樹膠，加蓋玻片，光學顯微鏡下觀察拍照。光鏡下凋亡細胞細胞核呈藍黑色為陽性，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野（200倍），每個視野計數(shù)100個細胞，每組3張共1 500個細胞，同時計數(shù)其中的陽性細胞數(shù)。凋亡指數(shù)（%）＝陽性細胞數(shù)/1 500×100%。

1.3.3 survivin檢測 通過Light Cycler 480熒光定量PCR擴增儀采用巢式逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）相對定量法檢測肺癌大鼠腫瘤組織中survivin（280 bp）特異性mRNA條帶并以β-actin（309 bp）為參照[5]。第一次反應使用中國上海Sangon生產的M-MLV一步法RT-PCR試劑盒測定β-actin（用作內部對照）和survivin。10μl RT-PCR反應系統(tǒng)分別包括2μg總核糖核酸（RNA），5μl 2×反應混合物，0.8μl正義鏈引物和反義鏈引物，0.2μl RT/Taq混合聚合酶和無菌雙蒸水加入到10μl RT-PCR反應系統(tǒng)。反應條件：在43℃反應60 min，在70℃下反應15 min，在94℃加熱以使反轉錄酶失活。survivin的反應條件：94℃變性30 s，53℃退火15 s，72℃延伸45 s，20個循環(huán)，然后在72℃溫育5 min。β-actin的反應條件：94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，然后在72℃溫育5 min。其中沒有RNA的反應體系用作陰性對比劑。第二次巢式反應通過使用MBI PCR試劑盒測定survivin，其模板由第一反應產生，以獲得巢式PCR。20μl反應體系分別是：3μl模板，2μl 10×PCR緩沖液，0.5μl Taq酶，6.5μl雙蒸水，2μl dNTP，2μl內部引物或巢式引物。反應條件：94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，然后在72℃溫育5 min。用10μl擴增產物，以80伏電壓進行2%瓊脂糖凝膠電泳30 min，用溴化乙啶染色，然后分析用佳能GIS-1000數(shù)字凝膠照相系統(tǒng)獲得的脫氧核糖核酸（DNA）電泳條。然后使用survivin與β-actin的比率作為存活蛋白表達水平的參數(shù)，以進行存活蛋白PCR產物的相對定量分析。引物序列。見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件，計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組SD大鼠的肺癌成瘤率比較 實驗過程中，由于麻醉過量、感染和惡病質，低濃度組大鼠死亡1只，對照組死亡1只，對照組在第24周肺癌成瘤率為72.41%（21/29），高、中、低濃度組大鼠肺癌成瘤率分別為36.67%（11/30）、43.33%（13/30）、55.17%（16/29），各組間肺癌成瘤率差異有顯著性。說明鼠曲草提取液對肺癌的形成有明顯抑制作用。

2.2 不同濃度鼠曲草提取液對細胞凋亡指數(shù)的影響 高、中、低濃度組大鼠肺癌細胞凋亡指數(shù)分別為（12.618 2±0.198 8）%、（11.348 7±0.182 8）%、（9.029 2±0.202 9）%；對照組肺癌細胞凋亡指數(shù)為（5.234 9±0.092 4）%；組間方差分析顯示差異顯著（P＜0.01），另相關性分析顯示大鼠肺癌細胞凋亡指數(shù)與鼠曲草濃度呈正相關。見表2。

表2 原位末端轉移酶標記法陽性細胞數(shù)

2.3 不同濃度鼠曲草提取液對大鼠肺癌組織中survivin表達的影響 高、中、低濃度組大鼠肺癌組織中survivin表達陽性率分別為81.82%（9/11）、84.62%（11/13）、87.50%（14/16）；對照組肺癌組織中survivin表達陽性率為95.24%（20/21），各組間差異不顯著。而高、中、低濃度組大鼠肺癌組織中survivin表達強度分別為0.338 9±0.030 2、0.512 7±0.050 6、0.792 9±0.060 3；對照組肺癌組織中survivin表達強度為1.139 5±0.078 0；組間方差分析顯示差異顯著（P＜0.01），另相關性分析顯示大鼠肺癌組織中survivin表達強度與鼠曲草提取液濃度呈正相關。見表3、圖1。

表3 大鼠肺癌組織中survivin表達

圖1 鼠曲草提取液對大鼠肺癌組織中survivin表達的影響

3 討論

近年來我國肺癌發(fā)病率明顯上升，與我國環(huán)境污染密切相關。苯并芘主要來源于煤焦油，各類碳黑、煤和石油等燃燒產生的煙氣、汽車尾氣、香煙以及焦化、煉油、瀝青、塑料等工業(yè)污水中，是一種高活性致癌劑，也是大氣致癌物的代表之一。故本實驗采用3,4-苯并芘肺內注射誘導大鼠肺癌，該方法操作簡單，實驗周期短，成瘤率高。濃度配為10 mg/ml，每次0.2 ml，每周1次，共4次，取得了較為滿意的成瘤效果。

鼠曲草在我國各地均盛產，以野生為主，也分布于日本、朝鮮、菲律賓、印度尼西亞、中南半島、澳大利亞等。每年清明節(jié)前后民間都有使用鼠曲草的習俗，各地民間食用方法不一，但基本都是全草食用，可新鮮食用，也可曬干貯存，或水煮或拌入米面后食用，故有“清明菜、清明果”之稱，是清明時節(jié)最早可食的野菜之一，營養(yǎng)豐富；同時也具有食療作用，可治療高血壓、支氣管炎、哮喘、風濕性腰痛等多種疾病，是民間傳統(tǒng)營養(yǎng)健康的野生蔬菜，有“仙草”之稱。本實驗采用鼠曲草水煮提取液代飲用水喂食大鼠，與民間加工、食用方法相似，通過本實驗證實鼠曲草水提取液有抗肺癌形成的功效。

鼠曲草具體成分十分復雜，含氨基酸、黃酮類化合物、揮發(fā)油、豆甾醇、生物堿等，據(jù)測定，鼠曲草全草含5%黃酮甙。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗過敏、抗腫瘤、抗突變、保肝等作用，有保護心腦血管系統(tǒng)、抗病毒以及殺蟲等廣泛的生理活性，且毒性較低[6～7]。Kozlowska J等[8]從新鮮鼠曲草花的甲醇提取物中分離得到一種新查耳酮和兩種黃酮類物質，2',4,4'-三羥基-6-甲氧基查耳酮（2',4,4'-trihydroxy-6'methoxychalcone）、木犀草素（luteolin） 和木犀草素-4'-D-葡萄糖苷（luteolin-4'-D-glucoside）。ChatsumpunN等[9]從鼠曲草中分離提取到4,4',6'-trihydroxy-2'-methoxychalcone、5,6-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone、5-hydroxy-3,6,7,8-tetramethoxyflavone、5-hydroxy-3,6,7,8,4'-pentamethoxyflavone等黃酮類化合物。Ahmady A等[10]從單花鼠曲草（Gnaphalium uniflorum Lan）乙醇提取液中分離提取得到6種黃酮類化合物，分別是槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside-4'-O-β-D-glucopyranoside）、蘆?。╮utin）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（quercetin-3-O-β-D glucopy ranoside）、異鼠李黃素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（isorhamnetin-3-O-β+D-galactopy ranoside）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol），通過LP-LUV實驗、DPPH實驗和UV-IP實驗證實了單花鼠曲草乙醇粗提物（ECR）及其主要黃酮類成分具有抗氧化作用、體外自由基清除及體內光防護等作用。Cho HJ等[11]研究結果顯示，木犀草素可通過激活p38/ROS/半胱天冬酶級聯(lián)來誘導肺癌細胞凋亡。Kasala ER等[12]研究發(fā)現(xiàn)口服木樨草素可通過降低苯并芘誘導肺癌的瑞士小白鼠體內脂質過氧化物，提高抗氧化物水平，還能有效降低苯并芘誘導的增殖細胞核抗原（PCNA），細胞色素P450 1A1和核因子κB，從而得出結論，木犀草素具有預防苯并芘誘導的肺癌潛在作用。

本課題組前期實驗[13]從鼠曲草中分離得到8個化合物，分別為β-谷甾醇、蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異澤蘭黃素、5-羥基-6,7,3,4-四甲氧基黃酮、槲皮素、木犀草素和芹菜素。其中鼠曲草中異澤蘭黃素（eupatilin）和5-羥基-6,7,3',4'-四甲氧基黃酮為首次從鼠曲草屬植物中分離得到，芹菜素（apigenin）為首次從該植物中分離得到。據(jù)國外研究報道鼠曲草成分中多種成分如apigenin[14～15]和eupatilin[16]等有較強的抗腫瘤作用。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，鼠曲草水提取液具有良好的抗腫瘤作用，且與其濃度相關；其作用機制可能主要與其抗氧化作用和自由基清除作用等相關，另外其促進腫瘤細胞凋亡的作用也是其抗腫瘤作用形成的關鍵，這與國內外相關報道一致。進一步從鼠曲草水提取液中找出其抗腫瘤的有效成分及其作用機制是擺在我們面前的一項難題，還需要進行相當繁瑣艱巨的實驗研究工作。