戚華文，徐 鑫，溫 柔，高德嵩，王超然， 劉艷芳，金紅利，梁鑫淼

(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023)

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck 的干燥幼果，具有破氣消積，化痰散痞的功效，常用于積滯內(nèi)停、痞滿脹痛、瀉痢后重、大便不通、痰滯氣阻、胸痹、結(jié)胸、臟器下垂等癥狀[1]。枳實(shí)中含有黃酮苷類成分，主要為柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷等[2-4]。現(xiàn)在藥理學(xué)研究表明，枳實(shí)具有促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等藥理活性[5-7]。枳實(shí)藥材資源分布廣泛，主產(chǎn)于江西、湖南、四川等地，以江枳實(shí)(江西清江)、湘枳實(shí)(湖南沅江)等為道地藥材，并根據(jù)直徑進(jìn)行枳實(shí)等級(jí)劃分，均以肉厚瓤小、質(zhì)堅(jiān)實(shí)、香氣濃者為佳。由于枳實(shí)產(chǎn)地廣泛且栽培品種繁多，市場上藥材質(zhì)量差異較大[8]，藥典中枳實(shí)僅以辛弗林為含量測定及鑒別對(duì)象，并不能完全反映藥材的品質(zhì)，因此建立一種簡單有效的分析方法對(duì)不同產(chǎn)地枳實(shí)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)顯得尤為重要。

指紋圖譜是鑒定中藥真?zhèn)?、評(píng)價(jià)其質(zhì)量一致性和穩(wěn)定性的可行性方法，通過光譜和色譜法獲得中藥的化學(xué)成分，具有信息量大、特征明顯、完整性和模糊性等特點(diǎn)[9-10]。中藥指紋圖譜可以反映出各種化學(xué)成分分布的整體狀態(tài),從而更全面地對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。本文采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)22批枳實(shí)藥材的指紋圖譜進(jìn)行研究，并利用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-QTOF-MS)聯(lián)用技術(shù)鑒定共有峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合聚類分析(CA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)其質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行研究，并探討枳實(shí)HPLC指紋圖譜共有模式在易混淆品枳殼中的鑒別應(yīng)用，為枳實(shí)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

表1 藥材樣品信息Table 1 Sample information of medicinal materials

高效液相色譜系統(tǒng)，包括2695梯度泵，2998二極管陣列檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱恒溫系統(tǒng)，Empower色譜工作站(美國沃特世公司)；MS204TS電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)，AB SCIEX X500系列QTOF質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX 公司)。Tnature-ACCHROM C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國沃特世公司)、Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國沃特世公司)、Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國安捷倫公司)。

新橙皮苷(批號(hào)B21390，規(guī)格20 mg，純度98.0%)購自上海源葉生物科技有限公司。藥材：枳實(shí)藥材S1～S22共22批，采自江西劉公廟、湖南、福建等地；枳殼藥材Z1～Z5共5批，采自江西劉公廟，各批次藥材質(zhì)量符合2020年版《中國藥典》，經(jīng)中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所楊小平鑒定，均為正品，具體信息見表1。乙腈、甲醇(4 L，色譜級(jí)，Sigma-Aldrich)；甲酸(500 mL，色譜級(jí),Aladdin)。實(shí)驗(yàn)室用水來自Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)(Billerica,MA,USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 HPLC-DAD色譜條件色譜柱：Tnature-ACCHROM C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%甲酸溶液(B)，程序洗脫：0～10 min,5%～18%A；10～35 min,18%～27%A；35～40 min,27%～48%A；40～60 min,48%～95%A；60～65 min,95%A；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為320 nm。

1.2.2 HPLC-QTOF-MS質(zhì)譜條件液相條件與上述相同。離子源：ESI 離子源；正離子模式；氣簾氣：241.3 kPa；Gas 1：379.2 kPa；Gas 2：379.2 kPa；溫度：550 ℃；離子化壓力：5 500 V，去簇電壓：80 V；全掃描范圍：m/z50～1 500；裂解電壓：40 V;CE Spread：20 V。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備取新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含新橙皮苷80 μg的對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備取枳實(shí)藥材粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz) 30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度取批號(hào)為S1的枳實(shí)藥材，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄特征圖譜。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1%，主要特征峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于5%，表明儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性取批號(hào)為S1的枳實(shí)藥材，制備供試品溶液，分別于0、6、12、18、24 h注入液相色譜儀，記錄特征圖譜。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，主要特征峰的相對(duì)峰面積的RSD小于5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復(fù)性取批號(hào)為S1的枳實(shí)藥材，制備6份供試品溶液，進(jìn)樣，記錄特征圖譜。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，主要特征峰的相對(duì)峰面積的RSD小于5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2 耐用性試驗(yàn)

2.2.1 色譜柱的影響取批號(hào)為S1的枳實(shí)藥材，制備供試品溶液，在相同色譜條件下，考察了規(guī)格均為250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm的Symmetry C18、Eclipse XDB-C18和Tnature C183根C18色譜柱對(duì)枳實(shí)特征圖譜的影響。結(jié)果顯示，在3根C18色譜柱上，枳實(shí)特征圖譜的色譜峰數(shù)目和分離度均無明顯差異。實(shí)驗(yàn)最終選用Tnature C18色譜柱。

2.2.2 柱溫的影響取批號(hào)為S1的枳實(shí)藥材，制備供試品溶液，考察20、25、30、35、40 ℃等不同柱溫對(duì)枳實(shí)特征圖譜的影響。結(jié)果顯示，5種柱溫條件下特征圖譜的分離效果無明顯差異，各色譜峰的峰形和分離度均較好。表明不同柱溫對(duì)枳實(shí)藥材特征圖譜的影響較小，最終選擇柱溫為30 ℃。

2.2.3 不同流速的影響取批號(hào)為S1的枳實(shí)藥材，制備供試品溶液，考察了0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min等不同流速對(duì)枳實(shí)特征圖譜的影響。結(jié)果顯示，不同流速條件下，枳實(shí)特征圖譜的分離效果差異不大，實(shí)驗(yàn)最終選擇流速為1.0 mL/min。

2.3 枳實(shí)指紋圖譜的建立

取22批(S1～S22)枳實(shí)藥材，按“1.3.2”制備枳實(shí)供試品溶液,按“1.2.1”依次進(jìn)樣檢測，采集22批枳實(shí)的HPLC指紋圖譜(圖1)。將S1～S22批枳實(shí)樣品的色譜圖全部導(dǎo)入《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2012版)，以S1批藥材的圖譜為校正參照，使用中位數(shù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，加以多點(diǎn)校正，可識(shí)別12個(gè)共有色譜峰，得到枳實(shí)藥材的對(duì)照譜圖(圖2A)，選擇出峰時(shí)間穩(wěn)定且相對(duì)居中的新橙皮苷峰作為參比峰。根據(jù)色譜峰匹配結(jié)果進(jìn)行相似度分析，得S1～S22指紋圖譜與共有模式對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為1.000、0.998、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、0.998、0.998、0.999、0.998、0.962、0.937、0.955、0.965、0.946、0.950、0.930、0.922、0.973、0.954。相似度結(jié)果顯示，22批枳實(shí)藥材的相似度均在0.9以上，無法區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)的枳實(shí)藥材。

2.4 指紋圖譜共有峰的指認(rèn)

為明確枳實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)組成，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-QTOF-MS對(duì)枳實(shí)中的化學(xué)成分進(jìn)行較全面的定性分析，從而提高其質(zhì)量控制水平。取批號(hào)為S1的枳實(shí)藥材，制備供試品溶液，按“1.2.2”的HPLC-QTOF-MS質(zhì)譜條件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，通過比對(duì)精確相對(duì)分子質(zhì)量和特征碎片離子，結(jié)合軟件推斷的分子式及文獻(xiàn)報(bào)道，鑒定出枳實(shí)11個(gè)共有峰，結(jié)果見表2。

2.5 聚類分析(CA)

以22批枳實(shí)指紋圖譜中12個(gè)共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 22.0軟件，采用組間均連法，選擇平方歐式距離為測度對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。根據(jù)CA結(jié)果(圖3)，22批枳實(shí)樣品分為2類，其中來自江西產(chǎn)區(qū)的樣品S1～S12聚為一類，來自福建和湖南產(chǎn)區(qū)的樣品S13～S22聚為一類，表明福建與湖南產(chǎn)區(qū)的枳實(shí)指紋圖譜相似度較高。對(duì)3省產(chǎn)區(qū)的枳實(shí)性狀進(jìn)行比較，結(jié)果表明，江西的枳實(shí)皮較厚、瓤囊較小，而湖南和福建兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的枳實(shí)性狀相近，但與江西產(chǎn)區(qū)枳實(shí)的性狀差異顯著。因此，聚類分析結(jié)果與性狀鑒別結(jié)果一致。

圖1 22批枳實(shí)藥材的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 22 batches of Citrus aurantium

表2 枳實(shí)特征峰的鑒定Table 2 Identification of characteristic peaks of Citrus aurantium

圖3 22批枳實(shí)藥材的聚類分析樹狀圖
Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 22 batches ofCitrusaurantium

圖4 枳實(shí)藥材樣品的PCA分析得分圖Fig.4 PCA scores of Citrus aurantium samples

圖5 枳實(shí)藥材樣品的OPLS-DA分析得分圖Fig.5 OPLS-DA scores of Citrus aurantium samples

圖6 枳實(shí)樣品的變量載荷評(píng)價(jià)參數(shù)(VIP)值Fig.6 Variable load evaluation parameter(VIP) value of Citrus aurantium samples

2.6 主成分分析(PCA)

PCA是采用線性投影將原來的多個(gè)變量空間轉(zhuǎn)化成一組新的正交變量的統(tǒng)計(jì)分析方法，可實(shí)現(xiàn)高維數(shù)據(jù)的降維處理，少數(shù)幾個(gè)主成分即可代表原始數(shù)據(jù)的大部分信息[11]。本實(shí)驗(yàn)采用SIMICA 14.1軟件，以22批次枳實(shí)樣品的共有峰峰面積為數(shù)據(jù)陣，對(duì)不同產(chǎn)區(qū)枳實(shí)藥材進(jìn)行主成分分析。根據(jù)得分圖(圖4)可以看出，江西產(chǎn)區(qū)枳實(shí)聚為一類，福建和湖南產(chǎn)區(qū)聚為一類，不同產(chǎn)區(qū)的枳實(shí)樣品存在差異性，與聚類分析結(jié)果一致。由圖4還可以看出，產(chǎn)區(qū)為湖南的樣品S23離散度較大，說明同一產(chǎn)區(qū)樣品的內(nèi)部差異性較大；而江西產(chǎn)區(qū)樣品分布較為集中，差異性較小。

2.7 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

為了更好地觀察樣品組間差異，采用有監(jiān)督的OPLS-DA模型對(duì)22批枳實(shí)進(jìn)行分析[12]，得分圖見圖5。由模型驗(yàn)證參數(shù)可知，數(shù)據(jù)矩陣的結(jié)實(shí)率參數(shù)R2X=0.893，模型區(qū)分參數(shù)R2Y=0.99，模型預(yù)測參數(shù)Q2=0.973，表明建立的模型穩(wěn)定且有較強(qiáng)的預(yù)測能力。從圖5中可以看出，江西產(chǎn)區(qū)與其他產(chǎn)區(qū)(福建與湖南)的枳實(shí)在OPLS-DA 圖中呈現(xiàn)了各自的特定區(qū)域，分離效果明顯。

為進(jìn)一步確認(rèn)對(duì)樣品分類貢獻(xiàn)度較大的成分，采用變量載荷評(píng)價(jià)參數(shù)值(VIP)進(jìn)行評(píng)價(jià)，該值可以體現(xiàn)變量對(duì)模型的整體貢獻(xiàn)水平。VIP 值越大，表明變量的貢獻(xiàn)程度越大，一般認(rèn)為，VIP值大于1的化合物在兩組分類中發(fā)揮了重要作用[13]。本實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)模型上2組間分類貢獻(xiàn)較大的3個(gè)變量(圖6)，影響大小依次為峰5(橙皮苷)、峰6(新橙皮苷)、峰4(柚皮苷)，說明可能是區(qū)分江西枳實(shí)與其他兩個(gè)產(chǎn)區(qū)(福建與湖南)枳實(shí)的質(zhì)量差異性物質(zhì)。

2.8 指紋圖譜的鑒別應(yīng)用

枳實(shí)與枳殼均來源于蕓香科植物酸橙，其中枳實(shí)為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck.的干燥幼果；枳殼為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，二者為同種藥材的不同時(shí)期，性狀比較相近，而功效和主治癥方面卻有很多不同[14]。本實(shí)驗(yàn)取5批枳殼藥材(Z1～Z5)，按“1.3.2”制備枳殼供試品溶液,“1.2.1”進(jìn)樣檢測，采集5批枳殼的HPLC指紋圖譜(圖2B)，并與枳實(shí)的HPLC指紋圖譜(圖2A)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，枳殼與枳實(shí)指紋圖譜在成分比例上存在較大差異，經(jīng)過中藥指紋圖譜相似度軟件處理兩個(gè)品種相似度為0.68，該方法所建立的指紋圖譜可用于二者的鑒別。

2.9 枳實(shí)含量的測定

表3 3個(gè)指標(biāo)成分的線性關(guān)系及線性方程Table 3 Linear relationships and linear ranges of three components

2.9.1 線性關(guān)系精密吸取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制成7個(gè)質(zhì)量濃度系列的混合對(duì)照品溶液，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)和線性范圍(見表3)。各化合物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999。

2.9.2 精密度、穩(wěn)定性與重復(fù)性取同一批次枳實(shí)樣品粉末(批號(hào)S1)，按“1.3.2”方法制備，稀釋10倍后按照“1.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.83%、2.72%、18.19%，RSD分別為0.54%、0.4%、0.4%。表明儀器精密度良好。

取同一批次枳實(shí)樣品粉末(批號(hào)S1)，經(jīng)上述樣品前處理后，稀釋10倍后分別于0、6、12、18、24 h進(jìn)行測定，計(jì)算得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.85%、2.74%、18.26%，RSD 分別為0.6%、1.3%、0.6%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

取同一枳實(shí)樣品粉末6 份(批號(hào)S1)，經(jīng)上述樣品前處理后，稀釋10倍后進(jìn)行測定，計(jì)算得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.73%、2.66%、17.92%，RSD 分別為0.8%、1.7%、1.1%。表明方法重復(fù)性良好。

2.9.3 回收率試驗(yàn)精密稱取枳實(shí)粉末6 份(批號(hào)S1)，每份約0.05 g，置于100 mL容量瓶中，分別加入柚皮苷3.78 mg、橙皮苷1.67 mg、新橙皮苷9.84 mg，精密加入甲醇，定容至100 mL，后續(xù)處理同“1.3.2”。按照“1.2.1”色譜條件測定，結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率分別為100%、92.5%、101%，RSD分別為1.3%、2.6%、1.1%。

2.9.4 含量測定通過對(duì)22 批枳實(shí)藥材進(jìn)行分析，測定枳實(shí)中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，測定結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，江西產(chǎn)區(qū)枳實(shí)的指標(biāo)成分含量范圍為：柚皮苷6.51%～8.35%、橙皮苷2.23%～4.15%、新橙皮苷16.92%～18.91%；湖南產(chǎn)區(qū)枳實(shí)：柚皮苷5.54%～5.87%、橙皮苷7.84%～9.81%、新橙皮苷14.22%～16.52%；福建產(chǎn)區(qū)枳實(shí)：柚皮苷4.81%～5.91%、橙皮苷7.23%～9.73%、新橙皮苷13.27%～15.71%。其中，湖南和福建產(chǎn)區(qū)的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量接近，但二者與江西產(chǎn)區(qū)存在一定差異。

表4 枳實(shí)中3種組分的定量分析Table 4 The quantitative result 3 of three components in Citrus aurantium (%)

(續(xù)表4)

3 結(jié) 論

本文對(duì)22批不同產(chǎn)區(qū)枳實(shí)藥材進(jìn)行了研究，建立了枳實(shí)藥材的定量指紋圖譜，標(biāo)定了12個(gè)共有峰，并通過HPLC-QTOF-MS指認(rèn)出11個(gè)成分。采用中藥指紋圖譜相似度軟件對(duì)22批枳實(shí)樣品的指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度均大于0.9，但無法確定不同產(chǎn)地差異性。因此，在指紋圖譜的基礎(chǔ)上，通過CA、 PCA 和 OPLS-DA對(duì)3個(gè)產(chǎn)區(qū)枳實(shí)藥材進(jìn)行了區(qū)分。結(jié)果顯示，3種化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果較為一致：江西產(chǎn)區(qū)枳實(shí)藥材聚為一類，福建和湖南產(chǎn)區(qū)枳實(shí)聚為一類；進(jìn)一步采用VIP值法進(jìn)行分析，篩選出橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷為差異性質(zhì)量標(biāo)志物。此外，采用同一分析方法對(duì)5批易混淆品枳殼進(jìn)行分析，其指紋圖譜與枳實(shí)差異較大，可用于二者的鑒別。本文建立的枳實(shí)HPLC指紋圖譜，方法簡單、可靠，可較為全面的反應(yīng)枳實(shí)化學(xué)信息，結(jié)合CA、 PCA 和 OPLS-DA對(duì)指紋圖譜進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，使結(jié)果更為全面科學(xué)，可用于枳實(shí)藥材的質(zhì)量控制。