王 帥，包永睿，李天嬌，楊欣欣，孟憲生*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116600)

中藥質(zhì)量是保障藥品安全有效、穩(wěn)定可控的基礎(chǔ)。同樣，中藥的質(zhì)量控制問(wèn)題一直是制約我國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題。我國(guó)現(xiàn)行的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式與控制體系主要以發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)化學(xué)藥品的質(zhì)量控制為借鑒。然而，化學(xué)藥品成分單一、療效與機(jī)制明確，對(duì)于含有成百上千種化學(xué)成分的單味中藥乃至中藥復(fù)方而言，該體系并不完全適用。在科技手段進(jìn)步與發(fā)展的同時(shí)，人們對(duì)中藥質(zhì)量檢測(cè)方法與手段的探索與革新也從未停止。以具有法定標(biāo)準(zhǔn)效力的《中國(guó)藥典》為例，從1953年至今已頒布11版，在薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等常規(guī)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步擴(kuò)大了對(duì)新技術(shù)、新方法的應(yīng)用，將液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法等用于中藥的質(zhì)量控制，以提高檢測(cè)的靈敏度、專屬性和穩(wěn)定性，加強(qiáng)對(duì)用藥安全性和有效性的保障。

質(zhì)控方法是手段，保障療效是目的，“找到有效成分”、“合理控制有效成分含量”是中藥質(zhì)量檢測(cè)的關(guān)鍵所在，是保障療效的核心問(wèn)題。為此，多年來(lái)廣大科研工作者做出了許多有益的探索，本文主要圍繞“發(fā)現(xiàn)”與“控制”有效成分的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法進(jìn)行探討，為豐富和完善中藥質(zhì)量控制方法，以及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的提升提供借鑒。

1 中藥“譜-效”關(guān)系研究

中藥譜效學(xué)的概念最早于2002年由李戎等提出[1]。它是指在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，將中藥指紋圖譜和藥效學(xué)通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)，建立以化學(xué)分析與生物活性評(píng)價(jià)相結(jié)合的綜合評(píng)價(jià)體系[2]。筆者統(tǒng)計(jì)了2002年1月～2020年9月CNKI中文期刊收錄的中藥“譜-效”關(guān)系研究相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)文章數(shù)量呈逐年上升趨勢(shì)(見(jiàn)圖1)。經(jīng)過(guò)近20年的實(shí)踐與發(fā)展，中藥譜效學(xué)在質(zhì)量控制方面，為中藥活性成分的篩選與質(zhì)控指標(biāo)的選擇提供了重要的參考依據(jù)。

中藥“譜-效”關(guān)系研究的目標(biāo)是尋找中藥化學(xué)成分差異與藥效差異的對(duì)應(yīng)關(guān)系。指紋圖譜的建立、藥效學(xué)評(píng)價(jià)及將二者相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)分析技術(shù)是中藥“譜-效”關(guān)系研究的3大基本要素(圖2)。

圖2 中藥譜效關(guān)系研究要素與方法Fig.2 Research elements and methods of the relationship between spectrum and effect of traditional Chinese medicine

1.1 指紋圖譜的建立

通常采用高效液相色譜法、氣相色譜法、液相/氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法或紅外光譜法等檢測(cè)手段，針對(duì)不同產(chǎn)地、不同采收期、不同提取工藝或不同批次(即含有變量)的中藥/中藥復(fù)方，建立相應(yīng)指紋圖譜。其中高效液相色譜法(HPLC)是應(yīng)用最為廣泛的方法，質(zhì)譜方法常用于進(jìn)一步的化學(xué)成分表征。王瑩等[3]利用HPLC建立了15批芍藥甘草湯煎液的指紋圖譜，探討了芍藥甘草湯物質(zhì)組分對(duì)癲癇小鼠腦組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和三磷酸腺苷(ATP)酶水平影響的譜效關(guān)系，篩選出芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷等對(duì)MDA、SOD和ATP的酶活性影響有貢獻(xiàn)的成分。呂婧等[4]采用液相色譜-串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-Q-TOF MS/MS)建立了20批不同產(chǎn)地西洋參皂苷類成分的指紋圖譜，研究了西洋參皂苷類成分指紋圖譜與其增強(qiáng)免疫力作用的譜效關(guān)系，結(jié)果在標(biāo)定的22個(gè)共有峰中，篩選出6個(gè)與增強(qiáng)免疫活性具有顯著相關(guān)性的成分。許平翠等[5]采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)建立了15批不同產(chǎn)地白術(shù)飲片揮發(fā)油的指紋圖譜，并研究了該指紋圖譜與抗氧化活性的相關(guān)性，分別篩選出揮發(fā)油清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基活性最強(qiáng)的5個(gè)成分和還原Fe3+能力最強(qiáng)的5個(gè)成分，證明了蒼術(shù)酮是白術(shù)主要的抗氧化活性物質(zhì)。此外，基于血清藥物化學(xué)理論，即“多數(shù)成分在發(fā)揮療效時(shí)首先要被人體吸收”理論，竇志華課題組[6]于2007年提出了中藥血清譜效學(xué)概念，將中藥“譜-效”關(guān)系研究提升到生物表達(dá)層面，豐富了譜效理論的研究?jī)?nèi)容[7]。竇志華等[8]通過(guò)將SD大鼠灌胃制備茵陳蒿湯及其各單味藥、各缺味方含藥血清，建立了不同方劑配伍組含藥血清的HPLC指紋圖譜，同時(shí)評(píng)價(jià)了不同方劑配伍含藥血清的保肝作用藥效，并尋找指紋圖譜中與藥效相關(guān)的色譜峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)源于大黃的蒽醌類成分及體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來(lái)源于梔子的環(huán)烯醚萜類成分及體內(nèi)代謝產(chǎn)物和西紅花酸類成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物是茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)，其中1個(gè)蒽醌類成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物活性較強(qiáng)。

1.2 藥效學(xué)評(píng)價(jià)

在藥效學(xué)評(píng)價(jià)方面，對(duì)于整體動(dòng)物、組織器官、細(xì)胞水平、分子水平4個(gè)研究層次均有文獻(xiàn)報(bào)道。涉及抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗?jié)儭⒖寡趸?、保肝、免疫調(diào)節(jié)、促胃腸動(dòng)力、補(bǔ)腎等諸多藥理活性。張希等[9]基于經(jīng)典名方五子衍宗丸的補(bǔ)腎益精作用，考察了不同批次五子衍宗丸提取物對(duì)雷公藤多苷致腎精虧虛證大鼠卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)、一氧化氮(NO)水平的影響，經(jīng)譜效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)五子衍宗丸補(bǔ)腎澀精藥效成分主要集中在水飽和正丁醇部位，對(duì)藥效貢獻(xiàn)最大的為綠原酸，其次為槲皮素。何前松等[10]研究了疏毛吳茱萸提取物指紋圖譜特征峰所代表的化學(xué)成分與緩解家兔離體腸平滑肌痙攣的相關(guān)性，篩選出主要活性物質(zhì)可能為吳茱萸堿、吳茱萸次堿、綠原酸及其異構(gòu)體、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、去氫吳茱萸堿、14-甲?；鋮擒镙谴螇A和檸檬苦素。樊佳新等[11]采用HPLC法建立了9種不同產(chǎn)地荊芥藥材乙醇提取物的指紋圖譜，并基于微流控芯片技術(shù)評(píng)價(jià)了不同產(chǎn)地荊芥藥材乙醇提取物誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡的抗腫瘤藥效，尋找二者之間的相關(guān)性，結(jié)果證明荊芥中發(fā)揮抗肺腫瘤作用的主要化學(xué)成分為香葉木素、木犀草苷、木犀草素、橙皮苷、芹菜素等。馬寧寧等[12]利用UPLC-Q-TOF MS建立了延胡索不同提取物的指紋圖譜，以核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)熒光素酶為標(biāo)志物對(duì)人體支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行抗炎活性實(shí)驗(yàn)，證明了黃連堿、小檗堿、巴馬汀、二氫血根堿和去氫紫堇堿是延胡索發(fā)揮抗炎作用的主要有效成分，并進(jìn)一步結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)推測(cè)延胡索通過(guò)作用于蛋白激酶C(PKC)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(ERK2)、抑制蛋白激酶β(IKKβ)、Janus激酶1(JAK1)、磷脂酰肌醇-3-激酶α(PI3K-α)、磷脂酰肌醇-3-激酶γ(PI3K-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)影響炎癥信號(hào)的傳遞。

1.3 數(shù)據(jù)分析技術(shù)

數(shù)據(jù)分析技術(shù)是建立譜效關(guān)系的重要組成要素。目前文獻(xiàn)報(bào)道的方法有相關(guān)分析(包括雙變量相關(guān)分析、多元相關(guān)分析、典型相關(guān)分析等)、回歸分析(包括多元線性回歸、偏最小二乘回歸等)、灰色關(guān)聯(lián)度分析、主成分分析、聚類分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。呂邵娃等[13]根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，將上述?shù)據(jù)分析技術(shù)歸為預(yù)測(cè)各成分與藥效間關(guān)聯(lián)度、闡明各成分對(duì)藥效貢獻(xiàn)率和簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)尋找主要活性成分3類。不同的數(shù)據(jù)處理方法，對(duì)中藥有效成分的篩選結(jié)果往往存在一定差異，應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法以及適用范圍選擇適宜的分析方法。

主成分分析、典型相關(guān)分析屬于簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的方法，是初步判斷化學(xué)成分對(duì)藥效貢獻(xiàn)大小的方法，在譜效關(guān)系研究中常與其他方法聯(lián)合使用。黃艷菲等[14]開(kāi)展了基于譜效關(guān)系的藏藥材全緣葉綠絨蒿全草(非花入藥部位)抗氧化質(zhì)量標(biāo)志物研究，首先采用主成分分析法對(duì)總抗氧化能力、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和抑制超氧陰離子自由基能力4項(xiàng)具有相關(guān)性的活性評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行降維處理，篩選出能最大程度反映抗氧化活性的指標(biāo)—DPPH自由基清除能力，并以其為代表進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析最終從29個(gè)共有峰中確認(rèn)槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-[2′′-O-乙?；?β-D-半乳糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]為全緣葉綠絨蒿全草的質(zhì)量標(biāo)志物。張華鋒等[15]開(kāi)展了基于聚類分析和典型相關(guān)分析的北柴胡保肝作用譜效關(guān)系研究，建立10批次柴胡皂苷的HPLC指紋圖譜后，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析將藥材按總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分為4類，進(jìn)而采用變量聚類分析法尋找指紋圖譜共有峰中各元素間的親疏關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷a和柴胡皂苷d聚為一類；將HPLC指紋圖譜共有峰和樣本間的藥效結(jié)果均數(shù)作為共同變量進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)藥效指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)與柴胡皂苷a、柴胡皂苷d具有較高的相關(guān)性，進(jìn)一步的典型相關(guān)分析也證明柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為北柴胡保肝作用的部分藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

灰色關(guān)聯(lián)度分析法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、雙變量相關(guān)分析法是預(yù)測(cè)各成分與藥效間關(guān)聯(lián)度的分析方法。其中灰色關(guān)聯(lián)度分析法的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較多，適用于樣本信息量單一、影響因素較復(fù)雜的圖譜。黃瀟等[16]運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法，開(kāi)展了梔子提取物抗炎作用譜效關(guān)系研究，在對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理后，以足腫脹度作為藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)各色譜峰與藥效間的關(guān)聯(lián)系數(shù)，篩選出對(duì)抗炎作用藥效貢獻(xiàn)排名前5的色譜峰，并鑒定出梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷2種成分。再分別以一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)4種炎癥因子為指標(biāo)，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)處理，進(jìn)一步證明了這5種成分的抗炎作用。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)于成分與藥效之間存在的非線性關(guān)系具備較好的預(yù)測(cè)能力，馬雯芳等[17]開(kāi)展了基于BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析滇桂艾納香止血作用的譜效關(guān)系研究，首先采用灰色關(guān)聯(lián)度法得到20批不同產(chǎn)地滇桂艾納香藥材指紋圖譜中13個(gè)共有峰與凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)3個(gè)止血藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)系數(shù)，找到與止血作用密切相關(guān)的色譜峰。再通過(guò)BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)MATLAB軟件建立譜效關(guān)系模型，運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)綜合藥效值，其相對(duì)誤差的絕對(duì)值均小于或等于13.6%，大部分?jǐn)?shù)值的相對(duì)誤差小于7.0%。在質(zhì)量控制過(guò)程中，可通過(guò)輸入指紋圖譜信息對(duì)其止血作用進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

偏最小二乘回歸分析法和多元線性回歸法能夠闡明各化學(xué)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)率。其中偏最小二乘回歸分析法是一種融合了多因變量對(duì)多自變量的回歸建模以及主成分分析在內(nèi)的多元數(shù)據(jù)分析方法[13]，可用于樣本數(shù)小于變量個(gè)數(shù)的數(shù)據(jù)分析，是目前中藥譜效關(guān)系研究中廣泛應(yīng)用并廣為認(rèn)可的方法。卞振華等[18]基于偏最小二乘回歸法開(kāi)展了五味子抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)活性部位譜效關(guān)系研究，以特征指紋圖譜中代表化學(xué)成分各峰的峰面積為自變量X，五味子抗MRSA活性部位的抑菌系數(shù)為因變量Y，進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，通過(guò)回歸系數(shù)得到各特征峰的貢獻(xiàn)大小，篩選出檸檬酸、蘋果酸異構(gòu)體為五味子抗MRSA的活性物質(zhì)。為了滿足不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮万?yàn)證活性成分篩選的準(zhǔn)確性，多種化學(xué)模式識(shí)別方法的綜合運(yùn)用趨勢(shì)明顯。王帥等[19]采用灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)合偏最小二乘回歸法，建立了朝鮮天南星、東北天南星與其抗肝腫瘤之間譜效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)通過(guò)譜效學(xué)篩選出的活性成分相似，并探討了朝鮮天南星作為地方習(xí)用品的合理性。徐碩等[20]分別采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法和雙變量相關(guān)性分析法，建立了羅布麻葉指紋圖譜與其體外抗氧化活性的譜效關(guān)系，兩種方法所得結(jié)果基本一致，并篩選出綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素和山柰酚為羅布麻葉抗氧化作用的活性物質(zhì)。

1.4 “譜-效”色卡可視化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)

雖然近年來(lái)中藥“譜-效”關(guān)系研究理論發(fā)展迅速，但在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的實(shí)際推廣應(yīng)用方面仍存在一些問(wèn)題。如多數(shù)中藥“譜-效”關(guān)系研究在藥效學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)，僅針對(duì)某一特定藥效展開(kāi)研究，而中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特性以及方劑配伍的影響，決定了其藥理活性、功能主治的非單一性，使得“譜-效”關(guān)系研究篩選出的有效成分往往僅具有參考價(jià)值，而不能成為法定質(zhì)量控制指標(biāo)，從而限制了其實(shí)際應(yīng)用。同時(shí)，科研應(yīng)以服務(wù)社會(huì)為目的，尤其是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立，既要考慮保障臨床療效安全、穩(wěn)定的“高標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)要求”，又要顧及藥品生產(chǎn)企業(yè)“低成本、低投入”的實(shí)際需求。為此，筆者課題組結(jié)合多年研究經(jīng)驗(yàn)，以典型中藥大品種氣滯胃痛顆粒復(fù)方質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立為例，首次開(kāi)發(fā)了“譜-效”色卡可視化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)[21]，探索中藥“譜-效”關(guān)系研究在中藥質(zhì)量控制方面的實(shí)際應(yīng)用。

圖3 “譜-效”色卡軟件可視化界面Fig.3 Visual interface of spectrum effect color card software

氣滯胃痛顆粒復(fù)方由柴胡、延胡索(炙)、枳殼、香附(炙)、白芍、炙甘草6味藥材組成，成分涉及黃酮類、生物堿類、皂苷類、三萜類等不同性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)組，具有促胃腸動(dòng)力、抗炎鎮(zhèn)痛、抗?jié)兌嘀毓π?。筆者課題組采用HPLC法建立了不同藥材配伍組氣滯胃痛顆粒指紋圖譜，分別以大鼠原代小腸平滑肌細(xì)胞、RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞、GES-1人胃粘膜上皮細(xì)胞構(gòu)建3種體外藥效模型，獲得不同配伍組藥理活性參數(shù)，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法分別構(gòu)建三者的譜效關(guān)系[22-24]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)揮不同功效的活性成分之間既存在一定相似性，又有所區(qū)別。如發(fā)揮促胃腸動(dòng)力作用的活性成分有柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、蕓香柚皮苷等，主要來(lái)自枳殼藥材；發(fā)揮抗炎作用的活性成分有甘草苷、蕓香柚皮苷、柴胡皂苷A、異甘草素、沒(méi)食子酸、甘草酸單銨鹽、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等，主要來(lái)自白芍、甘草等藥材；發(fā)揮抗胃潰瘍作用的活性成分有沒(méi)食子酸、甘草苷、甘草酸單銨鹽、芍藥苷、異甘草素、橙皮苷等，主要來(lái)自甘草等藥材[21]。在此基礎(chǔ)上，采用Visual Basic(VB)編程語(yǔ)言，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了“譜-效”色卡軟件，采用體外藥效模型獲得的成分-藥效關(guān)系數(shù)據(jù)進(jìn)行軟件程序校正與閾值設(shè)置，將企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)出的不同批次氣滯胃痛顆粒指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)該批次產(chǎn)品促胃腸動(dòng)力、抗炎鎮(zhèn)痛、抗?jié)冏饔玫膯我凰幚砘钚院途C合活性預(yù)測(cè)。經(jīng)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，“色卡”軟件輸出結(jié)果與其藥效結(jié)果趨勢(shì)一致。該研究實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單導(dǎo)入指紋圖譜即可預(yù)測(cè)藥效的中藥質(zhì)量可視化(圖3)，對(duì)于企業(yè)實(shí)現(xiàn)“高標(biāo)準(zhǔn)、低投入”的中藥質(zhì)量控制需求具有更為現(xiàn)實(shí)的意義。另外，此方法建立的中藥“譜-效”色卡綜合考慮了各成分間相互作用的藥效結(jié)果，經(jīng)體內(nèi)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，可逆向推斷藥效物質(zhì)基礎(chǔ)篩選的正確性與合理性，從而避免了譜-效關(guān)系研究產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果。

2 全時(shí)段等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合指紋圖譜

中藥的質(zhì)量控制正在由單一指標(biāo)向多指標(biāo)含量測(cè)定、定性與定量相結(jié)合的趨勢(shì)發(fā)展。中藥指紋圖譜憑借其整體性的特點(diǎn)，結(jié)合多指標(biāo)含量測(cè)定，能夠滿足上述質(zhì)量控制要求。然而，中藥復(fù)雜物質(zhì)體系中存在不同的化合物類別，其最大吸收波長(zhǎng)存在差異，單一波長(zhǎng)圖譜有時(shí)并不能全面反映化合物整體信息。為此，筆者課題組通過(guò)對(duì)紅花、丹參、川芎、甘草、余甘子、蛇床子、木蝴蝶等中藥材，及氣滯胃痛顆粒、大川芎片、復(fù)方木雞顆粒等中藥復(fù)方的多年實(shí)踐[25-27]，豐富、發(fā)展了多波長(zhǎng)融合指紋圖譜技術(shù)，提出“全時(shí)段等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合指紋圖譜技術(shù)”。該技術(shù)將現(xiàn)代分析檢測(cè)手段和信息處理手段結(jié)合，在保證基線穩(wěn)定不變的條件下，有效融合中藥多種指標(biāo)成分的譜圖信息，并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。所測(cè)成分均在最大紫外吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)，可以克服單一波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)由于檢測(cè)限高帶來(lái)的定量不準(zhǔn)、信息量不足等缺點(diǎn)，從而可較完善地反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量。如針對(duì)不同批次氣滯胃痛顆粒，選擇230、254、283 nm 3個(gè)波長(zhǎng)，Matlab軟件程序設(shè)計(jì)，建立了含有23個(gè)共有峰的多波長(zhǎng)融合指紋圖譜，同時(shí)對(duì)其中來(lái)自不同藥材、發(fā)揮不同藥理作用的白芍藥苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸鹽6種指標(biāo)性成分進(jìn)行了多指標(biāo)成分含量測(cè)定[28]。該方法穩(wěn)定、可靠，能夠?qū)鉁竿搭w粒復(fù)方進(jìn)行全面質(zhì)量控制。另外，將該技術(shù)與“一測(cè)多評(píng)”等評(píng)價(jià)方法相結(jié)合[29]，在全面、系統(tǒng)控制中藥質(zhì)量的同時(shí)還可以節(jié)約對(duì)照品，降低檢測(cè)成本，為合理的中藥質(zhì)量控制提供借鑒。

3 生物活性測(cè)定法

生物活性測(cè)定法是以藥物的生物效應(yīng)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定藥物有效性的一種方法，可達(dá)到控制藥品質(zhì)量的作用[30]。該方法將復(fù)雜的中藥活性成分作為“黑箱”，直接以藥效為切入點(diǎn)評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，逐漸受到中國(guó)、美國(guó)等國(guó)家的重視與認(rèn)可[31]。2010年版《中國(guó)藥典》發(fā)布了《中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則》，首次明確將中藥的生物活性評(píng)價(jià)方法作為中藥質(zhì)量控制的具體原則。該方法包括生物效價(jià)測(cè)定法和生物活性限值測(cè)定法，應(yīng)用時(shí)應(yīng)優(yōu)先選用生物效價(jià)測(cè)定法，對(duì)于不能建立生物效價(jià)測(cè)定的品種可考慮采用生物活性限值測(cè)定法?！端幍洹分胁捎媚傅味ǖ姆椒y(cè)定水蛭藥材抗凝血活性，用于水蛭藥材的質(zhì)量控制。謝曉華[32]以婦科千金片處方中具有抗菌作用的單面針和穿心蓮2味藥材為指標(biāo)，考察了它們的單煎混合液對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌4種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用，并根據(jù)建立的量效曲線測(cè)定了不同批號(hào)婦科千金片的生物效價(jià)。張莉華等[33]基于活血化瘀藥物多數(shù)具有的抗血小板聚集的作用機(jī)制，以中藥活性成分丹酚酸B作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立了家兔體外抗血小板聚集生物效價(jià)檢測(cè)方法，經(jīng)第三方實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證重現(xiàn)性良好。

生物活性測(cè)定法用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)起步較晚，仍存在某些問(wèn)題有待解決，如中藥所含化學(xué)成分復(fù)雜，尋找與待測(cè)樣品一致或活性相似的對(duì)照品具有一定難度，目前尚缺少生物測(cè)定用中藥標(biāo)準(zhǔn)品[34]；對(duì)于存在多種適應(yīng)癥的中藥，需對(duì)每種適應(yīng)癥分別建立相應(yīng)的生物活性檢測(cè)方法；目前的生物活性僅涉及抗菌、抗凝血、抗炎等相對(duì)簡(jiǎn)單的藥理活性，對(duì)于大部分復(fù)雜的中醫(yī)功效尚缺少公認(rèn)的藥理評(píng)價(jià)模型等。但對(duì)于功能主治明確，有效成分模糊，檢測(cè)方法不完善的中藥，生物活性檢測(cè)方法能夠?yàn)槠滟|(zhì)量控制起到一定的補(bǔ)充作用。

4 展 望

中藥質(zhì)量問(wèn)題是限制中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國(guó)家化發(fā)展的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題之一，完善中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法一直受到國(guó)家及廣大科研工作者的重視與廣泛關(guān)注。保障藥材質(zhì)量是保障中藥療效的根本，而“尋找”與合理“控制”中藥有效成分又是中藥質(zhì)量檢測(cè)的關(guān)鍵。中藥“譜-效”關(guān)系研究方法是“發(fā)現(xiàn)”有效成分的有力手段，多波長(zhǎng)融合指紋圖譜為合理“控制”有效成分提供了良好的檢測(cè)方法，而生物活性測(cè)定法則將中藥化學(xué)成分看作整體，從藥理活性角度入手建立評(píng)價(jià)方法，為豐富、發(fā)展中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供了良好借鑒。在以上基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及分析方法的研究工作尚有賴于廣大科研工作者不斷探索、創(chuàng)新和努力。