張海燕 武志佳 王延之 曹紀(jì)輝 趙昱東 朱明雙，

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.成都第一骨科醫(yī)院康復(fù)科，四川 成都 610000；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以關(guān)節(jié)疼痛、壓痛以及關(guān)節(jié)活動障礙等為主要臨床表現(xiàn)的退行性疾病,而關(guān)節(jié)疼痛及壓痛是OA最常見的臨床表現(xiàn)，故骨關(guān)節(jié)炎的治療常以緩解疼痛為目的[1-3]。馬錢子雖有大毒，但馬錢子及馬錢子復(fù)方制劑已廣泛用于各種疼痛治療[4-6]。有研究[6-9]發(fā)現(xiàn)，馬錢子可用于治療骨折腫痛、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕痹痛、腰腿痛等骨傷科疾病，且有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用，這提示馬錢子治療OA的巨大潛力。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門整合了分子生物學(xué)、計算機(jī)與大數(shù)據(jù)的新興學(xué)科，為研究中藥防治疾病的潛在靶標(biāo)研究提供了新思路和方法。故本文將運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析馬錢子治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶標(biāo)，以期馬錢子更好地服務(wù)于臨床。

1 資料與方法

1.1 主要數(shù)據(jù)庫

1.1.1 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP) 該數(shù)據(jù)庫提供了中藥的化學(xué)成分較全面的人體吸收、分布、代謝(ADME)性質(zhì)評價數(shù)據(jù)。而且還提供了潛在活性成分的靶標(biāo)及其疾病信息。

1.1.2 GeneCards數(shù)據(jù)庫 該數(shù)據(jù)庫是一個人類基因在線的綜合性數(shù)據(jù)庫，它自動整合約125個網(wǎng)絡(luò)來源的基因的數(shù)據(jù)，提供了簡明的基因、蛋白組、轉(zhuǎn)錄、遺傳和功能上所有已知和預(yù)測的人類基因。

1.1.3 在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(On line Mendelian Inheritance in Man,OMIM) 這是一個關(guān)于人類基因和遺傳疾病的綜合性數(shù)據(jù)庫，是具有全面性、及時性、權(quán)威性和實(shí)用性公認(rèn)的高效信息平臺[10]。

1.2 主要軟件 Cytoscape3.7.2,Perl軟件(V5.30.1)，R語言軟件(V3.6.2)

1.3 方法

1.3.1 檢索及篩選馬錢子及其主要成分 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到馬錢子所有已知成分共62種，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-likeness,DL)作為馬錢子化學(xué)成分的篩選條件，即OB≥30%，DL≥0.18為條件檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選出符合條件的中藥活性成分，共檢索到13個化學(xué)成分。

1.3.2 篩選出馬錢子主要活性成分相關(guān)的作用靶基因 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫，并運(yùn)用R語言和Perl軟件篩選出符合1.3.1條件馬錢子活性成分的靶基因，共計115個。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫，查詢靶基因與相對應(yīng)的Symbol，未有相對應(yīng)的則刪除，獲得91個靶基因。

1.3.3 構(gòu)建OA疾病相關(guān)靶基因基因數(shù)據(jù)庫 以“ostoarthritis”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，得到與人類OA相關(guān)的靶基因。其中GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索獲得2831個靶基因，OMIM數(shù)據(jù)庫獲得27個靶基因。

1.3.4 構(gòu)建藥物-疾病交集圖(Venny圖) 刪除GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲得的重復(fù)靶基因，得到OA疾病相關(guān)靶基因2858個，并刪除重復(fù)的藥物相關(guān)靶基因，獲得馬錢子相關(guān)靶基因44個，獲得二者交集的靶基因17個，構(gòu)建藥物-疾病的venn圖，并應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.3.5 構(gòu)建中藥-疾病相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò) 構(gòu)建中藥-活性成分-靶基因-疾病相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)即network，運(yùn)用Cytoscape3.7軟件，將network可視化。

1.3.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵蛋白篩選 將2.5獲得的中藥-疾病靶點(diǎn)基因的交集運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，分析靶點(diǎn)基因相互關(guān)系。相互作用評分設(shè)置為“medium confidence(0.40)”，并隱藏游離點(diǎn)，得到靶點(diǎn)基因之間相互關(guān)系的PPI網(wǎng)絡(luò)。然后對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲取關(guān)鍵靶蛋白10個。

1.3.7 GO功能和KEGG通路富集分析 將1.3.4獲得的中藥-疾病的17個靶基因進(jìn)行基因GO(gene ontology,GO)功能和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析，進(jìn)一步挖掘馬錢子防治OA的潛在靶標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 馬錢子主要有效成分 馬錢子主要活性成分篩選結(jié)果根據(jù)OB%和DL篩選出13個符合條件的有效成分，見表1。

表1 馬錢子主要有效成分Table 1 Main active components of nux vomica

2.2 構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)基因交集venn和PPI結(jié)果

2.2.1 藥物-疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因共17個(表2)，并將結(jié)果運(yùn)用Cytoscape3.7軟件可視化(圖1)。這17個靶基因可能是馬錢子治療OA關(guān)鍵靶基因，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)主要與核受體家族轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)，同時也涉抗炎和鎮(zhèn)痛相關(guān)的靶基因。

表2 馬錢子治療OA關(guān)鍵靶點(diǎn)Table 2 The key target of The treatment of OA by nux vomica

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)基因交集表Figure 1 Drug-disease target gene intersection table

2.2.2 運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出10個符合1.3.6條件的關(guān)鍵蛋白，并構(gòu)建了柱狀圖(縱坐標(biāo)代表蛋白的名稱；橫坐標(biāo)代表數(shù)目，數(shù)目越多代表蛋白居于關(guān)鍵中心)，PPI結(jié)果與2.2.1相一致，見圖2。

圖2 PPI關(guān)鍵蛋白柱狀圖Figure 2 PPI key protein bar chart

2.3 藥物-活性成分-基因-疾病相互關(guān)系可視化結(jié)果 黃色-疾病(OA)，藍(lán)色-中藥馬錢子，三角形綠色-活性成分，六邊形綠色-靶基因，見圖3。

圖3 藥物-活性成分-基因-疾病Figure 3 Drug-active ingredient-gene-disease

2.4 馬錢子治療OA的潛在靶點(diǎn)分析 GO功能分析結(jié)果顯示核受體可能是馬錢子治療OA的潛在藥物靶標(biāo)(圖4)；KEGG富集分析顯示馬錢子治療OA的相關(guān)信號通路主要有5條，包括雌激素信號通路、脂肪細(xì)胞脂解信號通路等，見圖5。

圖4 馬錢子治療OA關(guān)鍵靶點(diǎn)GO功能注釋(僅顯示示前20條)Figure 4 Notes on the function of the key targets in the treatment of OA

圖5 馬錢子治療OA關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路富集氣泡圖Figure 5 Bubble map of pathway enrichment involving key targets of nux vomica therapy for OA

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)并挖掘相關(guān)數(shù)據(jù)庫和應(yīng)用各種軟件探討馬錢子治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制和潛在藥物靶點(diǎn)，結(jié)果顯示馬錢子治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要有雌激素受體α(ESR1)、孕酮受體(PGR)、核受體亞家族3C組成員(NR3C1)、雌激素受體β(ESR2)、雄激素受體(AR)等，而這些都是核受體超家族(Nuclear receptor，NR)重要成員。同時，GO功能富集分析也發(fā)現(xiàn)馬錢子治療OA的基因功能與核受體家族相關(guān)，而這其中類固醇激素受體與馬錢子治療OA的關(guān)系最為密切。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，使研究者對OA的潛在靶點(diǎn)有了新的認(rèn)識。越來越多證據(jù)表明，核受體是治療OA潛在藥物靶標(biāo)[11-13]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，人關(guān)節(jié)軟骨中可以檢測到NR的表達(dá)，并且OA患者與健康者軟骨中的NR表達(dá)存在差異。

核受體在配體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，他們與其相應(yīng)配體(通常是指親脂小分子)結(jié)合誘導(dǎo)了它們作為轉(zhuǎn)錄激活因子的功能[14]。目前在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)48個NR轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)其配體可以將其分為類固醇激素受體，非類固醇激素受體，以及其各自的配體尚未被發(fā)現(xiàn)的“孤兒”受體[15]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示類固醇激素受體與馬錢子治療OA的關(guān)系最為密切。雌激素核受體ESR1和ESR2作為重要的類固醇激素受體，其廣泛分布于人體組織，且在關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨以及軟骨細(xì)胞亦有表達(dá)[16-18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，雌激素可以通過與ESR1和ESR2結(jié)合來參與骨發(fā)育成熟和骨代謝功能。但二者的作用并非一樣，研究證實(shí)，ESR1主要參與成骨細(xì)胞的生長，而ESR2與骨的形成與重吸收密切相關(guān)。而且OA患者ESR1基因與骨贅分級密切相關(guān)[20-22]。同時有學(xué)者在OA患者的滑膜細(xì)胞中鑒定出了類固醇激素受體(GR、AR、ERα、ESR2)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)關(guān)節(jié)內(nèi)糖皮質(zhì)激素注射后，類固醇激素受體(GR、AR、ESR1、ESR2)陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯減少[23]。此外，雌激素受體α陽性細(xì)胞的減少與疼痛和關(guān)節(jié)殘疾評分的VAS的改善顯著相關(guān)[24]。

馬錢子為馬錢科植物馬錢的成熟干燥種子，其鎮(zhèn)痛作用療效顯著，但馬錢子的毒副反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用，因此臨床運(yùn)用時應(yīng)嚴(yán)格遵照醫(yī)囑。安全用藥的關(guān)鍵是掌握適當(dāng)?shù)呐谥品椒翱刂朴昧浚?015版《中國藥典》規(guī)定馬錢子炮制后以丸散入藥效果為佳，成人每日安全用量為0.3～0.6 g。因?yàn)轳R錢子的治療量和中毒量接近，臨床用藥時須考慮患者體質(zhì)、年齡及基礎(chǔ)疾病等，同時從小劑量開始逐漸加量，以服藥后患者無口舌麻木、肌肉抽搐等癥狀為宜[7]。雖然隨著制藥技術(shù)的發(fā)展，馬錢子的新劑型越來越多，但2015版《中國藥典》記載馬錢子口服藥用劑型主要為散劑、片劑、丸劑及膠囊為主，外用主要以膏劑為主[25]。故我們研究了馬錢子治療OA時是基于其口服后在人體吸收、分布代謝。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)馬錢子治療OA具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。馬錢子治療OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括PTGS1、ESR1、PTGS2、PGR、NR3C1、HTR3A、OPRD1、ADRB2、SLC6A4、OPRM1、NOS2、AR、F7、ESR2、PLAU、CAT、HAS2，然后利用各種數(shù)據(jù)庫和軟件進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)基因涉及到核受體活性(nuclear receptor activity)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)，同時與雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中脂肪的信號(Regulation of lipolysis in adipocytes)等有關(guān)。此外，我們查閱相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬錢子治療OA的潛在靶點(diǎn)與核受體密切相關(guān)，而其中類固醇激素受體與OA最為密切，因此本文在這方面進(jìn)行了重點(diǎn)闡述。綜上，核受體家族某些成員(ESR1、PGR、NR3C1、ESR2)可能是馬錢子治療骨關(guān)節(jié)炎潛在藥物靶標(biāo)，這為馬錢子治療OA提供了新的研究方向。

4 結(jié)論

馬錢子治療OA具有多途徑、多成分、多靶點(diǎn)特點(diǎn)，核受體家族可能是馬錢子治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在藥物靶標(biāo)。