曾建軍，王寧

井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 吉安 343009

入侵植物因?qū)Νh(huán)境、生物多樣性等造成危害而受到廣泛關(guān)注，入侵機(jī)制是入侵生態(tài)學(xué)一個(gè)非常重要的研究?jī)?nèi)容，其中對(duì)繁殖機(jī)制的研究有助于揭示外來(lái)植物入侵和擴(kuò)張機(jī)理（Burrell et al.，2015；Van et al.，2015）。許多入侵植物同時(shí)進(jìn)行有性繁殖和無(wú)性繁殖，其中克隆生長(zhǎng)是最主要的無(wú)性繁殖方式（Douhovnikoff et al.，2003）?？寺∩L(zhǎng)不可避免會(huì)增加傳粉者在同一克隆內(nèi)訪花頻率，從而導(dǎo)致雌性適合度（如種子產(chǎn)量）下降（田昊等，2018），尤其是克隆構(gòu)型為密集型的植物，其交配系統(tǒng)存在異交向自交進(jìn)化的選擇壓力（Barrett et al.，2008）。但是，研究表明自然界中仍有許多密集型克隆生長(zhǎng)的植物仍保持專性異交特性，克隆植物如何規(guī)避克隆生長(zhǎng)帶來(lái)的同株異花授粉的影響，從而為異交提供更多的機(jī)會(huì)？該問(wèn)題引起越來(lái)越多的生態(tài)學(xué)家和進(jìn)化生物學(xué)家的關(guān)注（Barrett，2015）。克隆生長(zhǎng)通過(guò)影響克隆大小、種群克隆結(jié)構(gòu)等方面影響花粉傳播模式，進(jìn)而影響個(gè)體的有性繁殖成功（田昊等，2018）。對(duì)種群遺傳多樣性和克隆多樣性，將有助于了解種群更替動(dòng)態(tài)及繁殖策略（Torimaruet al.，2005；Mandel et al.，2019）。入侵植物在被引入到新的棲息地之后，必須克服一系列的障礙，最重要的一種障礙即為繁殖，其中必定蘊(yùn)涵著復(fù)雜多樣的適應(yīng)與進(jìn)化信息，對(duì)入侵克隆植物繁殖機(jī)制的研究，為揭示克隆生長(zhǎng)對(duì)有性繁殖的影響提供了很好的研究視角（Garcia et al.，2002；Bai et al.，2013）。

劍葉金雞菊（Coreopsis lanceolata）原產(chǎn)于北美，為菊科金雞菊屬多年生草本克隆植物，1936年作為園林植物引入我國(guó)江西廬山（萬(wàn)慧霖等，2008；許媛等，2009）。劍葉金雞菊具有密集和游擊型克隆生長(zhǎng)特性，雖然交配系統(tǒng)為專性異交，但克隆生長(zhǎng)并未影響到有性繁殖成功，單株種子產(chǎn)量大（曾建軍等，2010）。正因?yàn)檫m應(yīng)性、繁殖能力強(qiáng)，劍葉金雞菊逃逸為有害野生雜草，被列為我國(guó)主要外來(lái)入侵物種之一（徐海根等，2004）。江西廬山屬海拔直落差大的山地環(huán)境，是研究物種入侵與生態(tài)環(huán)境的一個(gè)天然的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)（萬(wàn)慧霖等，2008），本研究以江西廬山劍葉金雞菊不同海拔（低和高海拔）、不同人為干擾程度（干擾大的公路旁綠化帶和干擾小的荒地）種群為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)AFLP分子標(biāo)記方法分析種群遺傳多樣性、克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)，調(diào)查不同種群種子結(jié)實(shí)率，探討劍葉金雞菊克隆生長(zhǎng)對(duì)有性繁殖的影響，以期為揭示劍葉金雞菊入侵機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

樣地設(shè)置于江西廬山，地理坐標(biāo)在 115°50′—116°10′E，29°28′—29°45′N，總面積為 30500 hm2，具典型中亞熱帶季風(fēng)侯特征和山地氣候特色，年平均氣溫16.7 ℃，年平均降水量約1300 mm（楊道德等，2007）。

1.2 試驗(yàn)材料與分析方法

1.2.1 供試材料

選擇江西廬山高海拔公路旁綠化帶、高海拔荒地和低海拔荒地共3個(gè)劍葉金雞菊種群，各種群的基本情況見表1。將各種群按照50 cm×50 cm劃分的連續(xù)正方形，記錄空間坐標(biāo)（圖1）對(duì)每個(gè)點(diǎn)上的個(gè)體進(jìn)行定位取樣，每株取健康幼嫩葉片，放入裝有硅膠的密封袋中干燥保存?zhèn)溆茫↙i et al.，2009；Jiao et al.，2020）。依照 Douhovnikoff et al.（2003）的方法標(biāo)記7株不同基因型個(gè)體，每基株分別取3株克隆分株的葉片，共21個(gè)樣，同樣的方法干燥保存作為對(duì)照組，用于計(jì)算 Jaccard’s相似系數(shù)閾值（T）。

1.2.2 試驗(yàn)方法

1.2.2.1 DNA提取

采用的Wilson et al.（2005）方法提取總DNA。

1.2.2.2 AFLP分析

反應(yīng)總體系為20 μL，包括4 μL模板DNA（50 ng·μL-1），2 μL Hind III/Mse I，1 μL Adapter，2.5 μL 10 mM ATP，2.5 μL 10X Reaction buffer，7 μL AFLP-Water，1 μL T4 Ligase，混勻離心數(shù)秒，37 ℃保溫5 h，8 ℃保溫4 h，4 ℃過(guò)夜。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系 25 μL，含 2 μL 模板 DNA，1 μL dNTPs，1 μL Pre-ampmix，2.5 μL 10X PCR buffer，0.5 μL Taq DNA polymease，18 μL水。離心數(shù)秒，PCR擴(kuò)增循環(huán)30輪，擴(kuò)增參數(shù)：變性94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s下復(fù)性，延伸72 ℃條件下80 s，72 ℃ 5 min。按1∶20稀釋預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，作為選擴(kuò)模板。選擇性擴(kuò)增體系反應(yīng)體系25 μL，含預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品2 μL，0.5 μL dNTPS，2.5 μL 10XPCR buffer，1 μL（共 8 種）Mse I引物，1 μL（共 8 種）Hind III引物，0.5 μL Taq酶，17.5 μL H2O。擴(kuò)增程序如下：第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃，30 s；65 ℃，30 s；72 ℃，80 s。以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃，擴(kuò)增12輪，然后按94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，80 s參數(shù)擴(kuò)增23輪。通過(guò)ABI 377測(cè)序儀進(jìn)行AFLP多態(tài)性分析。從100個(gè)引物中篩選出清晰、不彌散、不模糊且重復(fù)性好的條帶，陰性對(duì)照中無(wú)帶的引物作為正式擴(kuò)增引物。擴(kuò)增使用8個(gè)引物序列：Eco-AAC/Mse-CAA；Eco-AAG/Mse-CAC；Eco-ACA/Mse-CAG；Eco-ACT/Mse-CAT；Eco-ACC/Mse-CTA；Eco-ACG/Mse-CTC；Eco-AGC/Mse-CTG；Eco-AGG/Mse-CTT。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

遺傳多樣性參數(shù)計(jì)算方法：對(duì)照反應(yīng)產(chǎn)物在凝膠上的對(duì)應(yīng)位置，統(tǒng)計(jì)電泳圖譜中70—500 bp的條帶，“1”為有帶，“0”為無(wú)帶，生成0/1矩陣。采用POPGEN 32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率、有效等位基因數(shù)（Effective numbers of alleles，Ne）、等位基因數(shù)（Observed number of alleles，Na）、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（Nei’s gene diversity，H）和 Shannon’s信息指數(shù)（Shannon’s information index，I）用來(lái)估算基因多樣性（宋振等，2019）。

采用Douhovnikoff et al.（2003）方法計(jì)算兩兩樣本是否來(lái)自同一克隆（基株）。計(jì)算同一種群兩兩樣本（x和y）間Jaccard’s相似系數(shù)Sxy，Sxy=n11/(n11+n10+n01)，n11是個(gè)體x和y都有的條帶數(shù)，n10是只在x個(gè)體上特異性條帶數(shù)量，n01是只在y個(gè)體上的特異性條帶數(shù)量。相似系數(shù)的計(jì)算用SPAGeDi 1.4軟件。當(dāng)兩植株間相似系數(shù)Sxy大于Jaccard’s相似系數(shù)閾值T值時(shí)，認(rèn)為這兩株植物屬于同一克?。ɑ辏╓ilson et al.，2005）。

采用以下3個(gè)參數(shù)估算克隆多樣性：（1）基因型比例（G/N）=G/N（Dorken et al.，2001；Liet al.，2009）；（2）Simpson多樣性指數(shù)（D）；（3）基因型分布均勻度（E）（Pielou，1969；李鈞敏等，2009）。

表1 劍葉金雞菊的不同生境概況Table 1 The conditions of the different habitants of C. lanceolata

圖1 種群基株分布圖Fig. 1 Distribution of genets in different population

結(jié)實(shí)率計(jì)算方法：選取樣地標(biāo)記 10個(gè)植株，每株選取果實(shí)5個(gè)，計(jì)算每株植株結(jié)實(shí)率以及每個(gè)種群的平均結(jié)實(shí)率。

3 結(jié)果與分析

3.1 劍葉金雞菊不同種群遺傳多樣性分析

對(duì)劍葉金雞菊種群遺傳多樣性分析表明（表2），3個(gè)種群多態(tài)性位點(diǎn)百分率（P）均很高，最低為廬山植物園種群（LBG）89.74%，最高石門澗種群（SMJ）可達(dá) 95.13%。Shannon’s指數(shù)最大的是石門澗種群（SMJ）為0.51，指數(shù)排序?yàn)槭T澗種群 (SMJ)＞牯嶺種群 (GL)＞廬山植物園種群(LBG)。以Nei’s多樣性指數(shù)（H）為指標(biāo)3個(gè)種群的排序與Shannon’s指數(shù)排序結(jié)果一致。

3.2 劍葉金雞菊不同種群克隆多樣性分析

為了辨別種群內(nèi)不同株是否來(lái)自同一克隆，通過(guò)對(duì)21個(gè)樣（7個(gè)不同基因型基株，每株分別取3個(gè)克隆分株）AFLP分析，計(jì)算出Jaccard’s相似系數(shù)閾值為0.88，即兩兩植株相似系數(shù)大于該閾值即認(rèn)為來(lái)自同一克隆。由表3可知，牯嶺（GL）種群的基因型比例和 Simpson多樣性指數(shù)最低（G/N=0.65，D=0.91），石門澗（SMJ）種群最高（G/N=0.88，D=0.98）?；蛐途鶆蚨龋‥）最高為廬山植物園（LBG）種群0.87，牯嶺（GL）和石門澗（SMJ）種群分別為0.53和0.57。3個(gè)種群克隆分株間平均距離1.2 m，范圍0.93—1.65 m，克隆分株最遠(yuǎn)距離為1.80 m。

3.3 不同種群劍葉金雞菊結(jié)實(shí)率分析

圖2結(jié)果表明，無(wú)論是高海拔還是低海拔種群，或者人工擾動(dòng)大的公路旁及干擾低的荒地種群，劍葉金雞菊均有較高結(jié)實(shí)率，每個(gè)種群結(jié)實(shí)率平均數(shù)在64.97%—70.93%之間，不同種群之間的結(jié)實(shí)率差異不顯著。

4 討論

本研究AFLP分子標(biāo)記分析結(jié)果表明，不同生境劍葉金雞菊天然種群均有較高遺傳多樣性。曾建軍等（2010）分析了劍葉金雞菊結(jié)實(shí)特征，其單株種子產(chǎn)量達(dá)到12000粒，種子千粒質(zhì)量 (1794±18)mg，種子萌發(fā)率在60%以上，落地可繁殖。我們推測(cè)有性繁殖能力強(qiáng)是劍葉金雞菊種群遺傳多樣性高的重要原因。由于天然屏障作用，入侵植物從低海拔向高海拔擴(kuò)散能力逐漸減低，植物的遺傳多樣性可能隨海拔升高而降低（Alpertet al.，2000；Pauchardet al.，2009）。但是Bustamante et al.（2017）研究發(fā)現(xiàn)入侵植物花菱草（Eschscholzia californica）從低海拔到高海拔遺傳多樣性并未減低的現(xiàn)象。通過(guò)分子標(biāo)記方法顯示，人類多次引入是入侵克隆植物Furcraea foetida(L.)引入地種群和入侵地種群均可保持高遺傳多樣性的重要因素（Barbosa et al.，2019）。劍葉金雞菊屬于多次引入園林植物（萬(wàn)慧霖等，2008），因此我們推斷，多次引入是劍葉金雞菊種群保持較高遺傳多樣性水平的原因之一。種群遺傳多樣性高有利于植物有性繁殖成功（Reed et al.，2003；Kettenring et al.，2019），劍葉金雞菊種群較高的遺傳多樣性同時(shí)也提高了有性繁殖適合度，促進(jìn)有性繁殖成功，提高入侵能力。

表2 劍葉金雞菊不同種群遺傳多樣性分析Table 2 Statistical analysis of genetic variation of C. lanceolata in different population

表3 劍葉金雞菊不同種群克隆多樣性分析Table 3 Statistical analysis of Clonal diversity of C. lanceolata in different population

圖2 劍葉金雞菊不同種群結(jié)實(shí)率Fig. 2 Setting rate of C. lanceolata in different population

克隆植物種群的基因型比例G/N的平均值約為0.44（Honnayet al.，2008），本研究中劍葉金雞菊3個(gè)種群基因型G/N平均值為0.77，較高G/N值表明劍葉金雞菊種群內(nèi)植株體大多來(lái)自不同基株，說(shuō)明游擊型生長(zhǎng)對(duì)提高劍葉金雞菊種群不同基因型混合度及拓殖種群的作用有限。有性繁殖是克隆植物種群保持較高基因型比例的機(jī)制（Bona et al.，2019；Hedrén et al.，2019），劍葉金雞菊種群較高的克隆多樣性進(jìn)一步表明有性繁殖是該物種種群更替非常重要的繁殖策略。Albert et al.（2008）認(rèn)為，種群克隆多樣性水平與異交率正相關(guān)關(guān)系，例如歐洲越桔（Vaccinium myrtillus）克隆多樣性高的種群異交率也更高。本研究中廬山3個(gè)劍葉金雞菊自然種群果實(shí)平均結(jié)實(shí)率均達(dá)64.97%以上，與人工模擬基因型均勻混合種群平均結(jié)實(shí)率64%基本一致（曾建軍等，2014），進(jìn)一步說(shuō)明劍葉金雞菊的克隆生長(zhǎng)并未影響異株異花傳粉，推測(cè)這與其種群克隆多樣性高密切相關(guān)。

花粉擴(kuò)散距離與克隆大小之間的關(guān)系也影響異交率。Sinclair et al.（2014）研究了克隆植物波喜蕩（Posidonia australis）的傳粉過(guò)程，通過(guò)水為媒介，花粉擴(kuò)散距離可達(dá)178 m，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其克隆平均大小30.8 m，因此保證了充足的異株異花花粉數(shù)量。在本研究中，劍葉金雞菊種群內(nèi)克隆分株間平均距離較小為1.2 m，最遠(yuǎn)距離僅1.8 m。曾建軍等（2014）研究了劍葉金雞菊主要傳粉昆蟲的一次最長(zhǎng)飛行距離雖然只有60 cm，但傳粉昆蟲在訪花過(guò)程中有多個(gè)飛行回合，訪問(wèn)的基株數(shù)最大達(dá)到6株，總飛行最遠(yuǎn)距離超過(guò) 1.8 m。而且我們也觀察到與其它伴生植物比較，劍葉金雞菊的克隆生長(zhǎng)產(chǎn)生了更大的花展示，吸引了數(shù)量眾多的傳粉昆蟲，提高了異株花粉資源輸出，因此保障了異交交配系統(tǒng)的繁殖成功。

5 結(jié)論

江西廬山劍葉金雞菊不同海拔（低和高海拔）、不同干擾程度（干擾大的公路旁綠化帶和干擾小的荒地）種群均有較高遺傳多樣性，有性繁殖能力強(qiáng)和多次引入是該克隆植物保持種群高遺傳多樣性的重要原因。種群較高的遺傳多樣性同時(shí)也提高了劍葉金雞菊有性繁殖適合度，促進(jìn)有性繁殖成功。種群克隆多樣性高減低了劍葉金雞菊同株異花授粉幾率，推測(cè)劍葉金雞菊的克隆生長(zhǎng)產(chǎn)生了更大的花展示，通過(guò)吸引數(shù)量眾多的傳粉昆蟲，提高異株花粉資源輸出，因此保障了劍葉金雞菊專性異交交配系統(tǒng)有性繁殖成功。