奎玲，王子君，李國榮，張廣輝，周玲*

1. 云南農業(yè)大學生物大數據學院，云南 昆明 650201；2. 江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3. 云南聚樂文化投資有限公司，云南 昆明 650220；4. 臨滄市茶葉科學研究所，云南 臨滄 677000；5. 云南農業(yè)大學龍潤普洱茶學院，云南 昆明 650201

土壤微生物生態(tài)是在一定時間和空間范圍內由微生物的個體、種群、群落與它們所在的土壤環(huán)境通過能量流動和物質循環(huán)所組成的一個自然體。土壤和作物管理因素（例如施肥）被認為是影響土壤質量的最重要因素（Hanet al.，2007；顧松松，2019）。茶園土壤特性、土壤微生物量及其活性之間的關系研究發(fā)現，茶樹的種植強度和持續(xù)時間對微生物群落結構、生物量及其功能有很大影響，其很可能是通過土壤酸化和添加肥料來實現的（Li et al.，2016；毛迎新等，2019；王海斌等，2020）。由于受到茶園土壤中微生物數量龐大、作用復雜、土壤本身的多變性與研究方法不完善等原因的限制，以往人們對茶園土壤微生物多樣性的研究相對較少。近年來，隨著分子生物學、宏基因組學與高通量測序技術的快速發(fā)展與完善，人們對茶園生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物群落的結構組成和生物多樣性與生態(tài)因素之間復雜的相互作用有了更深入的了解。同時，也有越來越多的研究者更加關注茶園土壤微生物多樣性的研究和保護（Zhao et al.，2012；Raaijmakers et al.，2016；Arafat et al.，2019；Tan et al.，2019）。有研究發(fā)現已建立的茶樹根際可能含有某些抑制微生物活性的物質，相對于放線菌與真菌來說細菌似乎是最敏感的一類（Pandey et al.，1996）。在酸性茶園土壤（pH＜6.0）中，土壤微生物的生長活性隨 pH的降低而下降（Koga et al.，2003），但也有研究發(fā)現茶園土壤微生物通常不受土壤pH的影響，并且還發(fā)現40年和90年歷史的茶樹土壤中的細菌和放線菌數量僅為 10年歷史的茶樹土壤中的一半，細菌在根層土壤的微生物群落中占主導地位（Yu et al.，2004）。

臨滄市因毗鄰瀾滄江而得名，是世界著名的“紅茶之鄉(xiāng)”、“黑茶之都”。自古以來，是“南方絲綢之路”和“西南絲綢茶葉之路”的重要節(jié)點，是茶馬古道上的咽喉要道，也是古茶樹遺產存量最大、最具代表性的地區(qū)之一。目前關于茶樹土壤微生物的絕大多數研究中只關注了細菌多樣性（16S），而很少關注真菌多樣性（ITS），并且在海拔驅動因素上的研究更少。同時據我們所知，目前還沒有關于茶樹土壤微生物種群的大樣本和跨區(qū)域研究數據。并且隨著高通測序技術的普及，16S和ITS擴增子測序技術已成為研究環(huán)境樣品中微生物群落組成結構的重要手段（毛迎新等，2019；楊廣容等，2019）。在本研究中，我們對臨滄市8個區(qū)縣的101個具有代表性的古茶園的土壤細菌與真菌群落動態(tài)進行了研究，通過測定茶園土壤pH值，明確不同茶園的pH梯度，通過分析不同經緯度和海拔的土壤樣品，研究不同種植地區(qū)中茶園土壤微生物多樣性、結構與分類學組成，探討導致土壤微生物群落產生變化的可能環(huán)境因子。另一方面，我們通過微生物分類來確定不同地區(qū)的茶園是否存在核心微生物組，并進一步確定這些核心類群的相對豐度及其在茶園微生物組中作為樞紐類群的潛在作用。本研究揭示了臨滄市古茶園土壤微生物的組成結構和多樣性，有利于進一步探索茶葉與其根際微生物的相互作用，為地方資源保護及茶樹育種提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

采集云南省臨滄市8個縣區(qū)（臨翔、雙江、耿馬、滄源、鎮(zhèn)康、永德、云縣、鳳慶）內的101個不同海拔、不同經緯度古茶園（圖 1）的根際土壤樣本，每個茶園采集6個樣本。首先，使用GPS儀對所采樣地點茶園的經緯度、海拔進行測定；然后使用地圖和無人機對采樣的古茶園進行勘察，根據采樣地的形狀和大小，確定適當的采樣方法，比如梅花形采樣法、棋盤式采樣法、蛇形采樣法等；隨后，使用事先已經消毒滅菌處理的器具進行取樣，采集離地面深20 cm左右的土樣并去除其中的茶樹根、石頭及其他雜質，每個樣本采集 3份：2 mL無菌保菌管兩份，50 mL無菌離心管一份，將采集的樣品放于液氮罐中速凍保存。

1.2 土壤pH值的測定

圖1 臨滄市101個古茶園的地理分布Fig. 1 Geographical distribution of 101 ancient tea plantations in Lincang City

用0.20 mm（50目）的尼龍篩將風干處理的土壤進行篩分，然后使用分辨率為0.001 g的天平稱取 (4.000±0.02) g土壤樣品于25 mL離心管，加入超純水 10 mL[土壤∶水=1∶2.5 (m/V)]，隨后利用旋渦混勻器最大振蕩頻率10 min，使土壤充分分散，室溫放置 30 min。這期間使用 pH標準溶液：pH=4.01、pH=6.86、pH=9.18、pH=12.46對pH儀進行矯正，隨后使用玻璃電極對處理后的土壤進行pH測定，每個樣品重復測定5次（Yan et al.，2020；Arafat et al.，2019）。

1.3 DNA提取、文庫制備和測序

根據Omega Biotek公司的E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒的操作說明對全部的土壤樣品進行總 DNA的提取。之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度，同時使用安捷倫Bioanalyzer 2100系統(tǒng)（Agilent Technologies，美國）測量DNA的濃度，取適量的樣本 DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至 1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區(qū)域的選擇，使用引物 F341（5′-CCTAYGGG RBGCASCAG-3′）和 R806（5′-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3′）對16S rRNA的V3—V4區(qū)域進行擴增（Wanyonyi et al.，2017；Jousselin et al.，2016），引物 ITS-1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和 ITS-1R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′）對 ITS1 區(qū)域進行擴增（Gardes et al.，1993；Li et al.，2019），所有引物都帶有Barcode。采用New England Biolabs公司的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffe和高效高保真酶進行PCR，16S rRNA的V3—V4區(qū)域和ITS1區(qū)域擴增PCR反應體系為：Phusion Master Mix 15 μL，Primer（F/R）1.5 μL，gDNA 10 μL，ddH2O 2 μL，PCR 反應程序為：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃30 s（30個循環(huán)）；72 ℃ 5 min。使用Qiagen凝膠提取試劑盒純化PCR產物（Qiagen，Germany）。遵循制造商的建議，使用TruSeq?DNA PCR-Free樣品制備試劑盒（Illumina，USA）制備測序文庫，并添加索引代碼。在 Qubit @ 2.0熒光計（Thermo Fisher Scientific，美國）和安捷倫Bioanalyzer 2100系統(tǒng)（Agilent Technologies，美國）上進行文庫質控。最后，該文庫在Illumina NovaSeq 6000平臺上測序，并產生了250 bp的雙末端讀段。

1.4 測序數據處理

根據barcode序列和引物序列從下機數據中拆分出各樣本數據，并截去其中包含的barcode序列和引物序列。先使用FLASH V1.2.7（Mago? et al.，2011）對每個樣本的 reads進行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數據（Raw Tags）；再根據QIIME2 V2019.10（Caporaso et al.，2010；Bolyen et al.，2019）質量控制流程獲得高質量的 Tags數據（Clean Tags）；最后將 Tags數據與參考數據庫（使用UCHIME算法的Silva數據庫）（Quast et al.，2013）進行比較檢測嵌合體序列，去除其中的嵌合體序列，并得到最終的有效數據（Effective Tags）。

使用 Uparse V 10.0.240（Edgar，R. C.，2013）軟件進行序列分析，將所有的樣品的有效數據根據相似度≥97%的一致性分配給相同的OTUs，最終篩選每個OTUs的代表性序列以作進一步分析。對于每個代表性序列，使用SILVA 132數據庫（用于16S rRNA基因序列）和UNITE數據庫（用于ITS基因序列）（Abarenkov et al.，2010）來指定分類學隸屬關系。為了研究不同的OTUs系統(tǒng)發(fā)育關系以及不同樣品（或者不同組）中優(yōu)勢種的差異，使用Muscle V 3.8.31（Edgar，2004）軟件進行了多序列比對。以序列最少的樣品為標準對OTUs的豐度信息進行歸一化，隨后基于歸一化的數據對alpha多樣性和beta多樣性進行分析。

1.5 數據統(tǒng)計和生物信息學分析

使用QIIME 2軟件計算樣本Chao1和Shannon指數來反映樣本內物種的復雜性與多樣性（Li et al.，2016；Bolyen et al.，2019），并使用 agricolae包的 kruskal函數（alpha=0.05，p.adj=“bonferroni”）進行多組間的差異分析。Beta多樣性分析用于評估樣本在物種復雜度上的差異，使用R V3.6.3軟件的vegan軟件包進行NMDS，Anosim與MRPP分析，用QIIME 2計算Unifrac距離并構建UPGMA聚類樹。使用psych包的corr. test函數計算微生物群落的相對豐度與環(huán)境和地理因子的 Spearman相關系數并檢驗其顯著性，并用pheatmap包進行可視化。利用 vegan軟件包進行冗余分析（RDA）和Mantel-test分析來比較茶園環(huán)境因子與微生物群落組成及結構的相關性。

2 結果

共采集了臨滄市101個古茶園的606份土壤樣本。但由于保存和運輸過程中的不可控因素，失去了107份土壤樣本；對剩余的土壤樣本進行總DNA的提取檢測、PCR擴增及文庫構建等實驗，最終從臨滄市101個古茶園中共獲得448份滿足上機測序的樣品。并且對這101個古茶園的地理位置進行統(tǒng)計分析發(fā)現，其分布于23—25°N和98—101°E之間，海拔介于900—2700 m間，每個古茶園含有3—6個不等的土壤樣品（圖1）。

2.1 101個古茶園土壤平均pH值

對上述448份土壤樣品的pH值進行了測定，結果發(fā)現，所有古茶園土壤的pH平均值介于3.90—6.30之間，全市平均值為4.66。參照前人的研究（Ruan et al.，2007；Yan et al.，2020）我們將測定的茶園土壤的pH平均值分為小于4.5，介于4.5—5.5之間以及大于5.5g共3個不同梯度，對我們的數據進一步分析發(fā)現，pH平均值小于4.5的采樣地有31個，pH平均值介于4.5—5.5的采樣地有68個，pH平均值大于5.5的采樣地有2個。

2.2 細菌和真菌群落的組成

經過拼接、質控與嵌合體過濾后，最終從 448份土壤樣品中共獲得84691條屬于16S rRNA基因V3—V4區(qū)域的有效序列與53228條屬于ITS區(qū)的有效序列。在 97%的序列相似度基礎上（Hume et al.，2019），將獲得的有效序列進行 OTU聚類，最終的數據集由主要隸屬于 65個細菌門的 21293個細菌的以及隸屬于17個真菌門的14978個真菌的可操作分類單元（OTU）組成。當OTUs的稀疏曲線逐漸趨于平緩時，表明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種，說明我們的數據可以進行下游分析。將獲得的所有OTUs分別從門到種的水平上進行了物種注釋，結果發(fā)現，在門分類水平上，占據主導地位的細菌主要包括 Proteobacteria（30.9%）、Chloroflexi（11.9%）、Bacteroidetes（6.4%），Acidobacteria（6.3%）、Actinobacteria（5.2%）、Firmicutes（4.6%），占到所有細菌和古細菌序列的65%以上，同時還有14.2%的OTUs不能被歸類。在科分類水平上，不能被歸類的 OTUs增加到53.1%，而那些被歸類到的細菌 OTUs的優(yōu)勢科主要包括 Ktedonobacteraceae（4.7%）、unidentified_Gammaproteobacteria（3.5%）和Gemmatimonadaceae（1.9%）。對于真菌來說，在門分類水平上主要包括 Ascomycota（34.7%）、Basidiomycota（16.6%）、Glomeromycota （7.7%），未分類的OTUs占到36.9%。在科分類水平上，優(yōu)勢類群為 Archaeorhizomycetaceae（4.8%），其次是 Glomeraceae（3.2%）、Clavariaceae（1.2%），未被分類的比例占到60.0%。

2.3 不同pH梯度下茶園土壤細菌和真菌群落組成及多樣性分析

根據2.1的結果，我們按照6個pH值梯度對微生物群落組成進行分析發(fā)現，在門分類水平上，對前10個細菌群落來說（下同），pH值的變化與群落的相對豐度變化間沒有明顯的關系，其中Acidobacteria、Actinobacteria和Proteobacteria在6個分組中都是優(yōu)勢細菌門（相對豐度＞10%），Acidobacteria和 Proteobacteria的相對豐度隨土壤pH的升高而先降后升，與土壤pH的變化沒有顯著的相關性，同時Actinobacteria的相對豐度變化趨勢與Acidobacteria的相反（圖2a）。對前10個真菌群落來說（下同），隨著pH值的升高群落的相對豐度逐漸下降，其中Ascomycota和Basidiomycota都是優(yōu)勢菌門，其相對豐度隨著pH值的升高逐漸降低，Mortierellomycota的相對豐度隨著 pH值的升高逐漸升高，在高pH組中為優(yōu)勢菌門，其相對豐度相對于低pH組差異顯著（圖2b）。

圖2 不同pH梯度分組中土壤細菌和真菌群落的相對豐度和α-多樣性指數Fig. 2 Relative abundance and α-diversity index of soil bacterial and fungal communities in different pH gradient groups

在屬分類水平上，除在最高pH組外，前20個細菌和真菌（下同）中菌屬的相對豐度與組成在其余組間均相似，其中Arthrobacter和Archaeorhizomyces在所有分組中分別是主要的細菌屬和真菌屬，Hygrocybe在除最高pH組外其余組中為主要的真菌屬，Penicillium和Saitozyma在低pH組中為重要的真菌屬，而在高pH組中變?yōu)镸ortierella。

α多樣性分析表明，pH為4.5—5.0組中土壤細菌群落的 Chao1指數和 Shannon指數均顯著高于pH為3.5—4.0和4.0—4.5組（P＜0.05），并且pH為5.0—5.5組中Shannon指數也顯著高于pH為3.5—4.0和 4.0—4.5組。相比之下，土壤真菌群落的Chao1指數和Shannon指數在所有分組之間沒有顯著差異（圖2c）。細菌和真菌群落的OTUs數在pH為4.5—5.0組中均最高，并且所有分組間細菌和真菌群落共有的OTUs數分別為6073、2260個。

此外，對不同梯度pH分組中茶園土壤微生物群落的 β多樣性的分析發(fā)現，細菌和真菌群落的NMDS分析均無法將其從6個不同梯度分組中的區(qū)分開來（圖3a、b）。但基于Anosim和MRPP函數對組間群落結構差異顯著性進行檢驗發(fā)現，不同pH梯度分組間有存在差異且具有統(tǒng)計學顯著性的分組，其中組間差異顯著大于組內差異的分組在真菌中較細菌更多，但這些分組間的差異相關性都較低（表1）?；赨PGMA聚類結果發(fā)現（圖4a、b），pH為4.5—5.0和5.0—5.5組間細菌群落結構相似性最高，真菌群落結構相似性在pH為4.0—4.5和4.5—5.0組間、5.0—5.5和5.5—6.0組間最高，并且最高pH組中細菌和真菌的組成與其它分組中其的組成差異最大，這些結果說明茶園土壤微生物群落的復雜化和多樣化在一定的pH范圍內趨于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖3 不同pH分組中土壤細菌（a）和真菌（b）群落的NMDS分析Fig. 3 NMDS analysis of soil bacterial (a) and fungal (b) communities in different pH groups

表1 Anosim和MRPP對不同pH梯度組的土壤細菌和真菌群落顯著性檢驗結果Table 1 Significance test by Anosim and MRPP of soil bacterial and fungal community in different pH gradient groups

圖4 不同pH分組中土壤細菌（a）和真菌（b）群落的UPGMA聚類樹分析Fig. 4 UPGMA cluster tree analysis of soil bacterial (a) and fungal (b)communities in different pH groups

2.4 不同海拔地區(qū)茶園土壤細菌和真菌群落組成及多樣性分析

根據前人對土壤微生物與海拔的研究結果（Shen et al.，2015；Tian et al.，2017；Nottingham et al.，2018；Wang et al.，2019），我們選擇在這種大尺度海拔梯度上對茶園土壤細菌和真菌群落的組成及多樣性分析進行了研究，結果發(fā)現14個不同海拔地區(qū)微生物群落的整體結構相近，在門分類水平上，海拔的變化與細菌群落的相對豐度變化沒有直接的關系，其中Acidobacteria和Proteobacteria在所有分組中都是優(yōu)勢細菌門，其相對豐度隨著海拔的升高基本呈現上升的趨勢，Actinobacteria是除高海拔組外其他組中的優(yōu)勢細菌門，其與 Firmicutes的相對豐度隨海拔的升高基本呈現相反的趨勢（圖5a）。隨海拔的升高真菌群落的相對豐度呈現先升后降的趨勢，其中Ascomycota和Basidiomycota在所有分組中都是優(yōu)勢真菌門，其中Ascomycota的相對豐度隨海拔的升高基本呈現上升的趨勢，而Basidiomycota則相反，其在最高海拔組中占絕對優(yōu)勢（52.4%）（圖5b）。

在屬分類水平上，細菌屬的相對豐度隨著海拔的升高呈現遞減的過程，并且其在低海拔組中相對于高海拔組中差異顯著，其中 Arthrobacter在除高海拔組外其余組間都是主要的細菌屬，其與Tumebacillus在海拔 900 m組中占主要地位，而Massilia在海拔1200 m組中占主要地位。真菌屬的相對豐度隨海拔的改變沒有明顯的趨勢改變，Archaeorhizomyces和Hygrocybe的相對豐度隨著海拔的升高基本呈現先增再減的趨勢，其在除低海拔組中都基本是主要的真菌屬，而 Penicillium和Saitozyma在低海拔組中是主要的真菌屬，并且在海拔2700 m組中占主要地位的優(yōu)勢菌屬為Russula和Coprinellus。

圖5 不同海拔分組中土壤細菌和真菌群落的相對豐度和α-多樣性指數Fig. 5 Relative abundance and α-diversity index of soil bacterial and fungal communities in different altitude groups

α多樣性分析發(fā)現，海拔2200 m組中土壤細菌群落的Chao1指數（除2300 m組外）和Shannon指數（除2300 m和2700 m組外）顯著高于其余組（圖5c），土壤真菌群落的Chao1指數和Shannon指數在所有分組間沒有顯著差異，但它們在海拔900 m組中均最高（圖5d），表明土壤細菌和真菌群落的α多樣性最高的分別是海拔2200 m和900 m。細菌和真菌群落的OTUs數在海拔1400 m和1800 m組中分別最高，所有分組間共有2869個細菌OTUs序列，但僅共有453個真菌OTUs序列。

此外，對不同海拔分組中茶園土壤微生物群落的 β多樣性分析發(fā)現，細菌和真菌群落的 NMDS分析均無法將其從不同海拔分組中的區(qū)分開來（圖6a、b）。但基于Anosim和MRPP檢驗發(fā)現，不同海拔分組間有存在差異且具有統(tǒng)計學顯著性的分組，其中細菌群落在海拔900 m相對于1300 m與2200 m組具有較高的顯著相關性（表 2）?；赨PGMA聚類結果發(fā)現，海拔900 m與1200 m組中細菌的結構較其他分組差異依次增大，但真菌的結構較其他分組差異增大是在海拔2700 m組，并且其余分組間細菌和真菌的結構基本在臨近海拔組中相似，這些結果說明隨著海拔的不斷升高，細菌和真菌群落趨于復雜化和多樣化，并且當海拔升高的一定高度時，其復雜化和多樣化水平又開始下降（圖7a、b）。

圖6 不同海拔分組中土壤細菌（a）和真菌（b）群落的OTUs分析Fig. 6 OTUs petal graph analyses of the soil bacterial (a) and fungal (b) communitiesin in different altitudes groups

表2 Anosim和MRPP對不同海拔分組的土壤細菌和真菌群落顯著性檢驗結果Table 2 Significance test by Anosim and MRPP of soil bacterial and fungal community in different altitudes groups

2.5 不同地區(qū)茶園土壤細菌和真菌群落組成及多樣性分析

按照采樣點的地理分布，我們對分布于8個縣區(qū)的古茶園進行了分析，在門分類水平上，不同地區(qū)茶園土壤細菌和真菌群落的相對豐度沒有明顯變化，但其相對豐度組成有著一定的差別，Acidobacteria和Proteobacteria在所有縣區(qū)都是優(yōu)勢細菌門，其中“CY”中 Acidobacteria的相對豐度顯著高于“LX”和“SJ”，并且 Actinobacteria和Firmicutes的相對豐度在“LX”和“SJ”中相比于其它6個縣區(qū)都差異顯著，Chloroflexi在所有縣區(qū)也占有7.7%—10.3%的相對豐度（圖8a）。相對豐度占到絕對優(yōu)勢的Ascomycota和Basidiomycota在所有縣區(qū)都是優(yōu)勢真菌門，其中 Basidiomycota的相對豐度在“CY”中最高且差異顯著相對于其它7個縣區(qū)（圖8b）。

圖7 不同海拔分組中土壤細菌（a）和真菌（b）群落的NMDS分析Fig. 7 NMDS analysis of soil bacterial (a) and fungal (b) communities in different altitudes groups

在屬分類水平上，細菌群落的相對豐度在“LX”和“SJ”中沒有顯著差異，并且“LX”和“SJ”中細菌群落的相對豐度遠大于其他 6個縣區(qū)，其中Arthrobacter、Bacillus和Kitasatospora是占比較高的主要細菌屬。同時也發(fā)現細菌群落的相對豐度在其它6個縣區(qū)中也沒有顯著差異，其中Acidibacter為主要細菌屬。真菌屬的組成和豐度在所有縣區(qū)中都存在差異，其中Amphinema和Inocybe是“CY”中最主要的真菌屬，Archaeorhizomyces是其余7個縣區(qū)中主要的真菌屬，并且“FQ”、“GM”和“SJ”主要的真菌屬還有Hygrocybe和Mortierell，Mortierell也是“LX”和“YX”的主要真菌屬，同時Penicillium也是“SJ”的主要真菌屬。

α多樣性分析發(fā)現，“SJ”中土壤細菌群落的Chao1指數顯著低于“YD”、“YX”和“ZK”，“LX”的Chao1指數也顯著低于“YD”和“YX”，并且“LX”和“SJ”中土壤細菌群落的Shannon指數顯著低于其余組，說明“YD”和“YX”中土壤細菌群落的α多樣性最高（圖8c）。土壤真菌群落的Chao1指數和Shannon指數在所有分組之間沒有顯著差異，與前面的分組類似（圖8c）。細菌和真菌群落的OTUs數分別在“SJ”與“LX”中最多，所有分組間共有 4389個細菌和 1564個真菌的OTUs序列。

圖8 不同地區(qū)分組中土壤細菌和真菌群落的相對豐度和α-多樣性指數Fig. 8 Relative abundance and α-diversity index of soil bacterial and fungal communities in different regional groups

β多樣性分析發(fā)現，細菌和真菌群落的NMDS分析均無法將其從 8不同縣區(qū)組中區(qū)分開來（圖9a、b）。但基于Anosim和MRPP檢驗發(fā)現，不同地區(qū)組間有存在差異且具有統(tǒng)計學顯著性的分組，其中細菌和真菌群落在“LX”中相對于其余分組具有較高的顯著相關性，并且真菌群落在“CY”中相對于其余分組也具有較高的顯著相關性（表3）?；赨PGMA聚類結果發(fā)現，“LX”與“SJ”，“YD”與“YX”中細菌和真菌的結構較其它組都相似性最高，“CY”中真菌的組成與結構較其它分組差異最大，這些結果說明不同地區(qū)茶園土壤細菌和真菌群落的組成與結構存在著一定差異和相似（圖10a、b）。

圖9 不同區(qū)域分組中土壤細菌（a）和真菌（b）群落的NMDS分析Fig. 9 NMDS analysis of soil bacterial (a) and fungal (b) communities in different regional groups

表3 Anosim和MRPP對不同區(qū)域分組中土壤細菌和真菌群落顯著性檢驗結果Table 3 Significance test by Anosim and MRPP of soil bacterial and fungal community in different regional groups

圖10 不同區(qū)域分組中土壤細菌（a）和真菌（b）群落的UPGMA聚類分析Fig. 10 UPGMA cluster tree analysis of soil bacterial (a) and fungal (b)communities in different regional groups

2.6 茶園土壤微生物群落組成與環(huán)境和地理因子的冗余分析和相關性分析

冗余分析結果表明，前兩個坐標軸僅分別解釋了細菌和真菌群落與土壤環(huán)境和地理因子之間關系的17.11%和33.95%。經度，緯度與海拔是顯著影響茶園土壤細菌群落的主要因素，同時海拔也是顯著影響土壤真菌群落的主要因素（圖11a、b）。Mantel-test分析進一步表明，在茶園系統(tǒng)中環(huán)境因子——pH值對群落作出的“選擇”能力有限，地理因子——海拔與緯度對其的影響相對更強烈（表4）。Spearman相關性分析被用來確定細菌和真菌群落的相對豐度與環(huán)境因子和地理因子之間的關系，我們發(fā)現除細菌門中的Proteobacteria外，其余門類都與緯度呈現極顯著正或負相關，并且經度與海拔對一些細菌門類也有類似的現象（圖11c），同時在屬分類水平上也發(fā)現，絕大多數細菌屬與緯度，海拔呈現極顯著正或負相關（圖 11e），但在真菌門或屬中都沒有觀察到類似的現象（圖11d、f）。

圖11 茶園土壤細菌（a）和真菌（b）群落的組成與環(huán)境和地理因子的冗余分析Fig. 11 Redundant analysis of the composition of soil bacterial (a) and fungus (b) communities and environmental and geographic factors in tea plantations

表4 環(huán)境和地理因子與細菌和真菌群落組成的Mantel-test分析Table 4 Mantel-test analysis of environmental and geographic factors and bacterial and fungal community composition

3 討論

土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)作為生物圈的基本結構單元，對全球性的能量、物質循環(huán)和轉化具有中重要的作用，其中最活躍和具有決定性影響的土壤微生物在物質的循環(huán)與能量的交換，土壤的形成與發(fā)展、植物與土壤相互作用，系統(tǒng)中所有已知的生態(tài)學過程的驅動，以及系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展等方面具有積極的作用（Urbina et al.，2018；Tan et al.，2019）。先前的研究發(fā)現，適宜茶樹生長的土壤pH為4.0—6.5，其中最適的土壤pH值為4.5—5.5，當土壤pH值低于4.0時茶樹的生長受到限制，土壤的理化性質將進一步的惡化；而當pH值高于6.5時茶樹的生長逐漸停滯，同時還伴隨著生長不良的現象，嚴重時甚至會導致植株的死亡（Ruan et al.，2007；Yan et al.，2020）。 中國茶園土壤酸化程度日益嚴重，茶園土壤的pH平均值為4.68，比森林土壤與經濟作物土壤都低；同時對云南省內161個的土壤樣本的pH值研究發(fā)現，其平均值為4.60，pH＜4.5 的占到 53.2%（Guo et al.，2010；Yan et al.，2020）。我們的研究發(fā)現，臨滄市內具有代表性的古茶園的土壤pH平均值為4.66，這與Yan et al.（2020）的研究結果相類似，其中有 30.7%的古茶園的土壤pH值小于4.5，只有67.3%的土壤對茶樹的生長最適宜。

一些研究發(fā)現，相對于8年與90年的茶園來說，50年的茶園中具有相對較高的群落多樣性（Xue et al.，2006）；茶樹的種植強度和種植年限對微生物群落結構，生物量及其功能有很大影響（Han et al.，2007）；荒地、茶園和林地之間的微生物遺傳多樣性指數存在顯著性差異，并且不同年齡的茶園，其土壤微生物遺傳多樣性指數，微生物生物量間也存在差異（Xue et al.，2007；Xue et al.，2008），這些結果表明茶園單一連作、茶齡、不同管理模式以及土地利用類型均對茶園土壤微生物群落多樣性，及其組成與結構均有顯著影響。本研究中，所有茶園采樣地土壤中的 Acidobacteria和 Proteobacteria（Alpha、Delta、Gamma）都是優(yōu)勢細菌門，同時Ascomycota和Basidiomycota都是優(yōu)勢真菌門，這與前人的研究結果類似，但其中一些細菌和真菌群落的組成與結構與單一連作和不同管理模式下的茶園土壤中微生物群落間還是存在著一些顯著區(qū)別（Zhao et al.，2012；Li et al.，2016；Arafat et al.，2019；Tan et al.，2019）。目前對Acidobacteria的生態(tài)學和新陳代謝尚無很好的了解，但這些細菌可能是生態(tài)系統(tǒng)的重要貢獻者，因為它們在土壤中特別豐富，特別是在資源利用率非常低的土壤中最為豐富（Quaiser et al.，2003；Fierer et al.，2007）；Alphaproteobacteria可以在非常低的營養(yǎng)水平生長，能夠在與植物共生的過程中誘導固氮，并且其和Gammaproteobacteria與大量的可用營養(yǎng)物質有關，同時Gammaproteobacteria中的成員被證明通過非核糖體肽合成酶來控制疾病抑制活性（Mendes et al.，2011；Li et al.，2016）；Deltaproteobacteria是硫循環(huán)厭氧過程的重要貢獻者；Ascomycota能夠促進土壤中動物和植物遺骸的腐爛，并分解其中的有機物使其被植物重吸收（Mendes et al.，2011）；Basidiomycota是真菌中最高等的一門，與植物共生形成菌根，有利于作物的栽培和造林，并且其與人類的生活關系密切。

之前的研究已經證實，Bacillus的許多種對已建立的茶樹的根面和根際都有很好的適應性，其中枯草芽孢桿菌（BacillusSubtilis）和芽孢桿菌（B.mycoides）與茶根關系密切，它們構成了細菌種群的主要部分，即使在不利時期也是如此；并且其作為茶樹根際中的優(yōu)勢細菌通過抑制菌絲體的生長并引起其結構異常，而表現出對真菌分離物的拮抗活性（Pandey et al.，1997；Singh et al.，2007）。Bradyrhizobium、Mycobacterium和Sphingomonas的相對豐度隨著茶樹種植年限的增加逐漸降低，Granulicella則相反，但對其生理代謝功能知之甚少，其中Bradyrhizobium在促進植物生長方面至關重要（Antoun et al.，1998；Wang et al.，2010）。不同樹齡茶樹根際中有大量的固氮菌，其中青壯年茶樹根際固氮菌的種類和數量都最為豐富。我們的研究發(fā)現，除Bacillus在所有的采樣地占有一定比例外，沒有發(fā)現其余菌屬明顯的存在。

茶園最適的土壤 pH值對土壤中微生物的生長和繁殖是有利的，但伴隨著茶園茶樹單一連續(xù)的種植，化肥（特別是氮肥）日積月累的使用，有機質的積累，以及受自身因素等方面的影響，使得茶園土壤酸化程度不斷加深，進而導致土壤中絕大多數適宜生存的有益微生物的種類和數量大幅度減少，并且其生物活性也變得較低（Yu et al.，2004；Abe et al.，2006；Ruan et al.，2007；Li et al.，2016；Yan et al.，2018）。有研究表明雖然森林土壤和茶園土壤具有相似的酸性 pH值，但它們之間的群落是不同的，說明茶園土壤中獨特的微生物群落組成與結構并不是僅僅由pH所塑造（Yao et al.，2000）。Koga et al.（2003）研究顯示在酸性茶園土壤中，土壤微生物的生長活性隨 pH的升高表現為先升后降低的趨勢。施加石灰可以控制茶園土壤酸化的問題，石灰的施加對土壤微生物群落結構有顯著影響，并且土壤中微生物群落的結構多樣性隨石灰濃度的增加而增加（Xue et al.，2010）。但Yu et al.（2004）對連續(xù)種植茶樹引起的土壤酸化及其對根際微生物的種群分布和群落結構的研究發(fā)現土壤微生物通常不受土壤pH值的影響。本研究發(fā)現茶園土壤細菌和真菌群落的組成和結構與pH的變化呈現單峰模式，真菌相對豐度受pH的影響較細菌更明顯，但其多樣性與pH的相關性較細菌更弱，細菌最適宜生活的pH值范圍為4.5—6.0，而真菌為4.0—5.5，這與茶樹適宜生長的土壤pH值研究結果相呼應（Ruan et al.，2007；Guo et al.，2010；Yan et al.，2020）。Li et al.（2016）的研究發(fā)現，茶園土壤中只有Acidobacteria中的Granulicella隨著 pH的降低而顯著增加，而Acidobacteria的相對豐度與土壤pH沒有顯著的相關性，這與我們的研究結果一致。同時一些研究發(fā)現，土壤細菌群落通常與土壤pH密切相關，其相對豐度和多樣性與pH呈正相關，這種模式既適用于總體細菌群落組成，也適用于單個細菌群的組成，但對真菌來說，其相對豐度不受pH的影響，并且其多樣性僅與pH呈弱相關，這表明茶園生態(tài)系統(tǒng)與其它如農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)相比具有一些相似性和特殊性（Jones et al.，2009；Rousk et al.，2010；Li et al.，2016）。此外，本研究還發(fā)現Archaeorhizomycetes在所有分組中均是優(yōu)勢真菌屬，并且在低pH梯度組中的相對豐度較高。序列特征表明Archaeorhizomycetes在低pH和高養(yǎng)分轉化的深層土壤中占據著植物根際，其相對豐度與真菌植物病原體Typhula，腐生真菌Exophiala，Suillus外生菌根家族，以及Tubeufia和Omphalotus均顯著相關，它們都參與了植被的腐爛過程（Carrino-Kyker et al.，2016；Choma et al.，2016；Pinto-Figueroa et al.，2019）。

先前的研究發(fā)現，土壤微生物多樣性，群落組成與結構，及其豐度與海拔具有顯著相關性，土壤微生物多樣性隨海拔升高而下降（Tian et al.，2017；Li et al.，2018；Nottingham et al.，2018），但一些研究還發(fā)現，土壤微生物不遵循動植物的海拔多樣性模式（Fierer et al.，2011），并且其中不同微生物類群呈現出不同的海拔分布規(guī)律；Bryant et al.（2008）發(fā)現細菌中的Acidobacteria的豐富度與多樣性隨海拔升高而單調降低；Wang et al.（2011）的研究發(fā)現細菌沿著海拔梯度呈現單調遞增模式；Singh et al.（2012）發(fā)現土壤細菌多樣性在海拔梯度上呈現單峰模式，但古細菌多樣性則表現出雙峰模式；Wang et al.（2019）發(fā)現各種固氮菌類群顯示出不同的豐度-海拔關系；Tian et al.（2017）發(fā)現真菌的豐富度隨著海拔的升高而降低，但其均勻度與海拔高度沒有顯著相關性；Shen et al.（2015）發(fā)現高海拔地區(qū)中的土壤細菌群落的組成是微生物中最復雜和多樣化的。我們的分析發(fā)現，茶園土壤細菌的菌群豐度隨海拔的升高呈現單峰模式，而菌群多樣性呈現雙峰模式，真菌的菌群豐度和菌群多樣性隨海拔的升高都呈現雙峰模式，這表明茶園土壤中細菌和真菌的多樣性，群落組成與結構存在一定差別，并且呈現出不同的海拔分布規(guī)律。序列組成分析發(fā)現，前 10個細菌門的相對豐度與海拔的變化沒有顯著相關性，而前 10個真菌門的相對豐度隨著海拔的升高呈現先升后降的模式，其中Acidobacteria和Proteobacteria呈現單調遞增趨勢，而Actinobacteria和Basidiomycota則相反，Arthrobacter在低海拔中的相對豐度相對于高海拔更高，但Penicillium的相對豐度在低海拔中占絕對優(yōu)勢，這與前人的研究相類似（Widden，2018；Kumar et al.，2019）。

茶園土壤微生物所生存的環(huán)境和地理因子是土壤微生物群落的組成與結構的重要驅動因素。先前的研究發(fā)現，茶園土壤pH作為主導因子與大多數分類群呈高度正相關或負相關，是影響茶園土壤細菌和真菌群落結構的關鍵因素，并且NO3-N，SOC和TOC也是影響細菌群落結構的主導因素，SOM和AP也是影響真菌群落結構的主導因素（Li et al.，2016；Arafat et al.，2019；Tan et al.，2019；顧松松等，2019；毛迎新等，2019）。Zhao et al.（2012）發(fā)現基于有限的數據，不能得出環(huán)境因子（pH）與茶園土壤細菌群落的關系，同時發(fā)現環(huán)境變量越相似，細菌群落結構越相似。我們的結果發(fā)現，不同環(huán)境因子和地理因子中的細菌和真菌群落具有類似的模式，前兩個坐標軸在門分類水平對細菌和真菌與土壤環(huán)境因子和地理因子之間關系的解釋率細菌較真菌低，但Mantel-test和Spearman相關性分析進一步揭示了緯度與海拔對細菌群落的組成與結構較真菌的更明顯（無論是在門分類水平還是屬分類水平上），雖然其與緯度和海拔都具有顯著相關性，但相關性普遍較低。

4 結論

臨滄市是世界茶樹最重要的地理起源中心和栽培起源中心地帶之一，本研究選擇臨滄市具有代表性的古茶園土壤微生物為研究對象，分析茶樹生長的地理環(huán)境因素對茶園土壤細菌和真菌群落的組成結構及多樣性的影響。細菌最適宜生活的 pH值范圍為 4.5—6.0，而真菌為 4.0—5.5，因此，茶樹生長最適宜的土壤 pH值為 4.5—5.5；真菌相對豐度受pH的影響較細菌更明顯，但其多樣性與pH的相關性較細菌更弱。不同地區(qū)茶園土壤細菌和真菌群落的組成與結構存在著一定差異和相似，經度、緯度與海拔是顯著影響茶園土壤細菌群落的主要因素，同時海拔也是顯著影響土壤真菌群落的主要因素。在門分類水平上，海拔的變化與細菌群落的相對豐度變化沒有直接的關系，而真菌群落相對豐度隨海拔升高先升后降，在屬分類水平上相反，真菌群落相對豐度隨海拔變化沒有明顯差異，而細菌群落相對豐度隨海拔升高而遞減。但總體而言，隨著海拔的不斷升高，細菌和真菌群落趨于復雜化和多樣化，并且當海拔升高的一定高度時，其復雜化和多樣化水平又開始下降。對分布于人類活動區(qū)與非活動區(qū)的茶園的土壤細菌和真菌群落的相對豐度及其多樣性分析發(fā)現，細菌和真菌群落的相對豐度和多樣性在人類活動區(qū)與非活動區(qū)間并沒有顯著區(qū)別?；谖覀儸F有的數據，研究結果表明，茶園千百年來長期處于茶農的管理與選擇下，其土壤微生物群落的組成與結構，以及其豐度與環(huán)境和地理因子間的相關性被人為“馴化”，在茶園系統(tǒng)中，主要發(fā)生人為活動對真菌群落做出的“選擇”，而不是環(huán)境或地理因子的限制；而細菌群落更多是“選擇”對所生活的環(huán)境的適應，而不是對人為活動的適應，生活環(huán)境對細菌群落的“壓力”相對于人為活動更強烈。