向凡舒，龍旭霞，趙楠，侯強川，郭壯*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

作為一類傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品，泡菜可分為泡漬泡菜和鹽漬泡菜兩大類[1]。較之泡漬泡菜，鹽漬泡菜無需泡制發(fā)酵，制作工藝包括鹽漬、清洗整形、脫鹽脫水和配料鹽制等環(huán)節(jié)[2]。泡菜的制作屬厭氧自然發(fā)酵，其中蘊含的微生物類群對泡菜風(fēng)味品質(zhì)的形成具有重要的作用[3]，有研究指出地理環(huán)境[4]、原料[5]、制作方式[6]、發(fā)酵溫度[7]和鹽濃度[8]等因素均對泡菜微生物類群的形成具有明顯的影響。泡菜中的微生物類群主要來源于蔬菜原料表面的乳酸菌[3]，而制作泡菜的原料通常包括蘿卜、白菜、豇豆、青椒和萵苣等各類新鮮蔬菜，但由于品種、季節(jié)和產(chǎn)地等因素的影響，不同原料表面攜帶的乳酸菌類群可能存在差異[2]。Liang H等[5]研究表明白菜泡菜鹽水中的優(yōu)勢細(xì)菌為乳酸桿菌，而混合蔬菜鹽水中的優(yōu)勢細(xì)菌為乳酸桿菌和魏斯氏菌。明確泡菜中微生物類群構(gòu)成是控制和提升泡菜品質(zhì)的關(guān)鍵，因而探討發(fā)酵方式和原料等因素對泡菜中微生物類群的影響，對提升泡菜品質(zhì)和食用安全性具有積極的意義。

位于恩施土家族苗族自治州的宣恩縣有以沙蔥（Allium mongolicum Regel）和切絲的青椒（Capsicum annuum var.grossum）為原料進行鹽漬泡菜制作的習(xí)俗。當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶制作發(fā)酵沙蔥的方法如下：將洗凈的沙蔥放入濃鹽水中漂洗兩遍后瀝干，加入食鹽和陳醋置于壇中密封發(fā)酵10 d左右即可制得發(fā)酵沙蔥，除無需使用濃鹽水漂洗外，發(fā)酵青椒的做法與沙蔥相同。由此可見，相同的地理環(huán)境及相似的制作工藝，為探討原料這一因素對鹽漬泡菜細(xì)菌類群的影響提供參考。

本研究采用MiSeq高通量測序技術(shù)對宣恩縣發(fā)酵沙蔥和發(fā)酵青椒樣品的細(xì)菌多樣性進行解析，同時對其細(xì)菌基因功能進行預(yù)測，進而探討原料對鹽漬泡菜細(xì)菌類群及基因功能的影響，以期為后續(xù)相關(guān)鹽漬泡菜制品生產(chǎn)工藝的改良提供理論指導(dǎo)，同時為發(fā)酵沙蔥等特色發(fā)酵蔬菜制品微生物多樣性的理論研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

發(fā)酵沙蔥和青椒樣品：市售；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；引物338F/806R：天一輝遠(yuǎn)（武漢）生物科技有限公司；10倍緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

Veriti FAST梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國 ABI公司；R920 型機架式服務(wù)器：美國DELL公司；164-5050基礎(chǔ)電泳儀：美國BIO-RAD公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

納入本研究的樣品均于2018年12月下旬采集自湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣三橋菜市場。發(fā)酵沙蔥編號為YSC1、YSC2和YSC3，發(fā)酵青椒編號為QJ1、QJ2和QJ3。所有樣品均在當(dāng)?shù)刂谱骱弯N售，樣品采集時其制作時間約在20 d～30 d。

1.2.2 基因組DNA提取、PCR擴增和高通量測序

每個樣品各取2 g，使用試劑盒提取微生物的總DNA，并參照文獻[9]中的方法進行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR擴增，PCR產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

參照文獻[9]中的方法對下機序列進行質(zhì)控后，將合格序列上傳至QIIME（V1.7.0）分析平臺進行微生物類群分析，依次進行序列對齊、分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）劃分[10]、序列比對[11]、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[12]、α多樣性和β多樣性分析[13]。

將同一類鹽漬泡菜中平均相對含量>1.0%的門、屬和OTU，定義為優(yōu)勢門、屬和OTU；若每個樣品都含有某一OTU，則將該OTU定義為核心OTU；若某一OTU在3個發(fā)酵沙蔥樣品中均存在，而在3個發(fā)酵青椒樣品中均不存在，則將其定義為發(fā)酵沙蔥樣品的獨特 OTU，反之亦然[14]。

1.2.4 基因功能預(yù)測

使用phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states（PICRUSt）軟件預(yù)測鹽漬泡菜中細(xì)菌的基因功能[15]，并參照蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫（clusters of orthologous groups of proteins，COG）進行注釋[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用曼惠尼（Mann-Whitney）檢驗對各α多樣性指標(biāo)和各基因功能類別指標(biāo)進行顯著性分析；使用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和基因功能的整體差異性進行分析；使用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）聚類對兩類鹽漬泡菜的β多樣性進行分析。采用R語言實現(xiàn)數(shù)據(jù)的可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序情況和α多樣性分析

本研究采用MiSeq高通量測序技術(shù)對發(fā)酵沙蔥和發(fā)酵青椒的細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)進行解析，6個樣品測序共得到了225 242條序列，每個樣品平均測序深度為37 540條，其中有5條序列經(jīng)對齊后比對失敗，剩余225 237條序列依據(jù)97%相似性劃分了OTU，共得到了10 213個OTU，每個樣品平均含有1 702個OTU，其中發(fā)酵沙蔥中共有7 689個OTU，發(fā)酵青椒中共有6 763個OTU。所有樣品的測序情況和各分類學(xué)地位數(shù)量見表1。

表1 樣品測序結(jié)果統(tǒng)計Table 1 Sequencing results of samples

由表1可知，對OTU中代表性序列進行同源性比對，將所有序列鑒定為26個門、64個綱、105個目、204個科和444個屬，不能鑒定到門和屬的序列數(shù)分別占總序列的0.18%和11.96%。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵沙蔥超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均顯著偏高（P<0.05），因而其細(xì)菌的豐度和多樣性均高于發(fā)酵青椒。制作發(fā)酵青椒所使用的辣椒品種為二荊條，其辣度在5 000～15 000史高維爾指標(biāo)（scoville heat units，SHU），其中含有的辣椒素和辣椒堿等活性成分具有一定的抑菌作用，這可能是導(dǎo)致其細(xì)菌豐度和多樣性低的主要原因[17]。Jeong等[18]的研究亦表明，在泡菜中添加辣椒粉會影響泡菜在發(fā)酵初期微生物的演替和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致泡菜發(fā)酵過程減慢。

2.2 β多樣性分析

本研究進一步采用基于UniFrac距離的加權(quán)和非加權(quán)UPGMA對兩類鹽漬泡菜菌群差異性進行了分析見圖1。

圖1 基于OTU水平加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離的UPGMAFig.1 UPGMA based on weighted and unweighted UniFrac distance at OTU lever

由圖1A可知，除QJ1和QJ2形成一個聚類外，其他同類樣品并未呈現(xiàn)出明顯的聚類趨勢，而由圖1B可知，QJ2和QJ3形成一個聚類，YSC1和YSC2形成一個聚類，因而基于非加權(quán)分析的同一類樣品間聚類趨勢要明顯于加權(quán)分析。較之UPGMA，基于UniFrac距離的UPGMA考慮了不同物種在進化譜系中的遺傳距離[19]，同時在此基礎(chǔ)上進行的加權(quán)分析還進一步考慮了OTU中序列豐度，而非加權(quán)分析僅考慮OTU中序列的有和無，有即為1，無則為0[20]?；贠TU相對含量矩陣，本研究進一步使用MANOVA對兩類鹽漬泡菜微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性進行了分析，結(jié)果顯示差異顯著（P<0.05）。由此可見，雖然在聚類圖中存在交疊現(xiàn)象，但兩類鹽漬泡菜的微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

2.3 基于門、屬和OTU水平的相對含量比較

發(fā)酵沙蔥（A）和發(fā)酵青椒（B）中優(yōu)勢菌門相對含量如圖2所示。

圖2 發(fā)酵沙蔥和發(fā)酵青椒中優(yōu)勢細(xì)菌門相對含量Fig.2 Relative abundance of dominant bacterial phyla in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖2可知，發(fā)酵沙蔥中的優(yōu)勢細(xì)菌門為Proteobacteria（變形菌門，49.92%）、Firmicutes（硬壁菌門，45.77%）、Actinobacteria（放線菌門，2.18%） 和 Bacteroidetes（擬桿菌門，1.44%）；發(fā)酵青椒中的優(yōu)勢細(xì)菌門為 Proteobacteria（68.70%）、Actinobacteria（17.05%）、Firmicutes（10.08%）和 Bacteroidetes（2.30%）。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵沙蔥中Firmicutes的相對含量顯著偏高（P<0.05）。

發(fā)酵沙蔥（A）和發(fā)酵青椒（B）中優(yōu)勢細(xì)菌屬的相對含量如圖3所示。

圖3 發(fā)酵沙蔥和青椒中優(yōu)勢細(xì)菌屬相對含量Fig.3 Relative abundance of dominant bacterial genera in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖3A可知，發(fā)酵沙蔥中有11個優(yōu)勢細(xì)菌屬，分別為隸屬于Firmicutes的Lactobacillus（乳酸桿菌屬，22.8%）、Lentibacillus（慢生芽胞桿菌屬，7.68%）、Weissella（魏斯氏菌屬，5.03%）、Gracilibacillus（糖球菌屬，3.70%）、Oceanobacillus（海洋桿菌屬，1.78%）和Bacillus（芽孢桿菌屬，1.51%），隸屬于 Proteobacteria的Pantoea（泛菌屬，13.54%）、Acinetobacter（不動菌屬，5.74%）、Pseudomonas（假單胞菌屬，5.70%）、Erwinia（歐文氏菌屬，3.21%）和 Rahnella（拉恩氏菌屬，3.11%）；由圖3B可知，發(fā)酵青椒中有8個優(yōu)勢細(xì)菌屬，分別為隸屬于Proteobacteria的Pseudomonas（假單胞菌屬，31.35%）、Obesumbacterium（肥桿菌屬，7.70%）、Rouxiella（2.10%）和 Psychrobacter（嗜冷桿菌屬，1.61%），隸屬于Actinobacteria的Thermoleophilum（棲熱嗜油菌屬，16.31%）和 Kluyvera（克呂沃爾氏菌屬，8.93%），隸屬于Firmicutes的Lactococcus（乳球菌屬，3.08%）和Lactobacillus（乳桿菌屬，2.30%）。經(jīng) Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵沙蔥中 Lactobacillus、Pantoea、Lentibacillus和Rahnella的相對含量顯著偏高（P<0.05）。沙蔥為百合科蔥屬植物，有研究表明Pantoea allii可導(dǎo)致與沙蔥同一屬的洋蔥發(fā)生枯萎病[21]，因而發(fā)酵沙蔥中存在Pantoea的原因可能在于制作過程中使用了患枯萎病的原料。由此可見，兩類鹽漬泡菜細(xì)菌類群在屬水平上存在較大的差異。

發(fā)酵沙蔥中存在68個特殊OTU，累計平均含量為8.40%，其中24個OTU隸屬于Pantoea，累計含量達5.54%；4個OTU隸屬于Pseudomonas，累計含量達0.025%；3個 OTU隸屬于 Rahnella，累計含量達0.045%；而其他OTU均不可鑒定到屬水平，且平均相對含量均低于0.01%。發(fā)酵青椒中存在2個特殊OTU，分別被鑒定為Lactobacillus和Bacteroides，平均相對含量分別為0.007%和0.03%。由此可見，兩類鹽漬泡菜在含量較低的OTU上存在一定的差異。

2.4 核心細(xì)菌類群的研究

在對不同樣品中獨特OTU進行甄別的基礎(chǔ)上，進一步對核心OTU進行了解析。共發(fā)現(xiàn)35個核心OTU，累計平均相對含量為17.23%，其中平均相對含量>1.0%的如圖4所示。

圖4 發(fā)酵沙蔥和青椒中優(yōu)勢核心OTU相對含量Fig.4 Relative abundance of dominant core OTUs in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖4可知，共有6核心OTU平均相對含量>1.0%，累計平均相對含量達到12.34%，其中OTU4948、OTU789、OTU3975、OTU3978、OTU2257 和 OTU2191 的平均相對含量為3.38%、2.95%、2.16%、1.78%、1.07%和1.01%，除 OTU4948和 OTU789被鑒定為 Thermoleophilum外，其他4個OTU被依次鑒定為Weissella、Pseudomonas、Acinetobacter和 Lactobacillus。由此可見，雖兩類鹽漬泡菜在含量較低的細(xì)菌類群上存在差異，但亦共有部分相同的細(xì)菌類群。

2.5 基于PICRUSt功能預(yù)測分析

發(fā)酵沙蔥和發(fā)酵青椒細(xì)菌類群功能大類的注釋結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵沙蔥和青椒細(xì)菌基因功能預(yù)測Fig.5 Predict gene functions of bacteria in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖5可知，所有細(xì)菌共注釋到了4 166個GOG，分別隸屬于23個功能大類，且兩類鹽漬泡菜在氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝（E）、碳水化合物運輸與代謝（G）以及轉(zhuǎn)錄（K）功能上均具有較高表達，而在RNA的加工與修飾（A）、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)（B）和細(xì)胞運動（N）等功能上的表達較低。經(jīng)Mood-median檢驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵青椒中細(xì)菌在能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換（C）、氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝（E）、核苷轉(zhuǎn)運與代謝（F）和轉(zhuǎn)錄功能（K）的表達上顯著偏高（P<0.05）。由圖5可知，不同類型的樣品呈現(xiàn)出明顯的聚類趨勢，其中YSC1、YSC2和YSC3形成一個聚類，QJ1和QJ3形成一個聚類?；诨蚬δ茴A(yù)測數(shù)據(jù)矩陣，本研究進一步使用MANOVA對兩類鹽漬泡菜基因功能的整體差異性進行了分析，結(jié)果顯示差異顯著（P<0.05）。由此可見，兩類鹽漬泡菜細(xì)菌基因功能的表達存在顯著差異。

3 結(jié)論

兩類鹽漬泡菜在細(xì)菌類群和基因功能的表達上均存在顯著差異，其中發(fā)酵沙蔥細(xì)菌類群的豐度和多樣性及硬壁菌門、乳酸桿菌屬、慢生芽胞桿菌屬、泛菌屬和拉恩氏菌屬的相對含量均顯著偏高，而菌群能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝、核苷轉(zhuǎn)運與代謝和轉(zhuǎn)錄等功能基因的表達均顯著偏低。由此可見，原料對鹽漬泡菜的細(xì)菌類群與菌群基因功能的表達具有顯著的影響。