白利琴，楊新，李沖，李研東，肖妙，郝建雄，趙丹丹，劉璐，李晟霖，韓雪*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省獸藥監(jiān)察所，河北 石家莊 050002；3.石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，河北 石家莊 050041）

雪燕（tragacanth gum）為木髓分泌物，原產(chǎn)于地中海東部干旱地區(qū)、亞洲西南部、北部高原和沙漠[1]。因產(chǎn)品性狀與燕窩相似而得名，并被引入中國。但是，目前對雪燕成分及功能性的認(rèn)知和研究少有報道。隨著大眾對養(yǎng)生追求的不斷提高，人們對雪燕產(chǎn)品的需求逐漸擴(kuò)大。然而，雪燕質(zhì)量良莠不齊，一方面由于缺乏專門的學(xué)者研究，另一方面市場沒有與它相關(guān)的準(zhǔn)則進(jìn)行約束，因此，深入研究雪燕的營養(yǎng)成分及其功能性勢在必行[2-3]。

多糖，又稱多聚糖，是由10個以上的單糖分子通過糖苷鍵聚合而成的一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)[4]。在食物營養(yǎng)成分中，活性多糖是能夠起到調(diào)節(jié)人體機(jī)能作用的生物活性物質(zhì)種類中重要的一種[5]。根據(jù)多糖理化性質(zhì)的不同，其提取方法通常包括傳統(tǒng)的水提醇沉法、酸提法、堿提法，或是采用超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解法等新興技術(shù)手段，以提高其提取效率[6]。雪燕作為樹髓分泌物，其多糖的溶出不受植物細(xì)胞壁的約束限制，因此，本研究關(guān)于雪燕多糖的提取采用成本低、污染少、安全的傳統(tǒng)方法進(jìn)行提取，并將提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

不同來源的多糖具有不同生物學(xué)功能。研究表明，植物多糖通常具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤抑制、治療心腦血管系統(tǒng)疾病、抗病毒等多種生理功能[7-10]。其中，抗氧化作用體現(xiàn)在植物多糖可保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性，防止超氧陰離子自由基的攻擊；可與羥基自由基形成有關(guān)的金屬離子相結(jié)合，抑制羥自由基的產(chǎn)生；能清除細(xì)胞內(nèi)過多的自由基，減輕活性自由基對免疫系統(tǒng)的損傷或保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子免受直接攻擊而起到抗癌的作用[11-14]。本試驗對雪燕多糖的體外抗氧化效果進(jìn)行分析評價，將為后續(xù)相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪燕：印度BOZI購買，于40℃烘箱中烘干，含水量為5%，打粉機(jī)粉碎過60目篩后裝于自封袋中，備用。

鄰苯三酚：美國Sigma公司；葡萄糖、無水乙醇、苯酚、L-抗壞血酸（VC）（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；2，2’-連氮基-雙-（3 乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）、1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：北京索萊寶科技有限公司；鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸：源葉生物有限公司；三氯乙酸、甲醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、過硫酸鉀（分析純）：天津市百世化工有限公司；三氟乙酸、氫氧化鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1，2-dihydro-5-methyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-one ，PMP）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗儀器

S433D全自動氨基酸分析儀：德國Sykam；iCap Q電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（inductively coupled plasmamass spectrometry ，ICP-MS）：Thermo Fisher Scientific；1200 液相色譜儀：Agilen；SPECTROstarNano酶標(biāo)儀：德國BMG；FW80型粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；HC-3018高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HH-4水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雪燕微量元素含量的測定

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法[15-17]測定雪燕中微量元素的含量。稱取樣品0.3 g（精確到0.0001g），置于消化罐中，加入硝酸4.0mL，浸泡30min；加入雙氧水1.0 mL浸泡過夜，裝入消解裝置，設(shè)定溫度為165℃，時間為12 min啟動儀器。計時完成后等待3 min～5 min即可把消解罐從微波爐中取出，冷卻20 min后即可在通風(fēng)櫥內(nèi)打開消解罐。將消解完成的樣品試劑轉(zhuǎn)移到25 mL比色管中定容，溶液靜置澄清后上機(jī)測定，測定參數(shù)如表1所示。

表1 ICP-MS的儀器參數(shù)Table 1 ICP-MS instrument parameters

1.3.2 雪燕中氨基酸含量測定

1.3.2.1 樣品前處理

稱取試樣約100 mg（準(zhǔn)確至0.1 mg）于20 mL安瓿瓶中，加入10.00 mL 6 mol/L鹽酸溶液，搖勻，充氮氣2 min，封管。將水解管放入110℃恒溫干燥箱中水解22 h～24 h。冷卻，混勻，過濾；取0.2 mL的濾液，60℃濃縮至干；用1 mL pH 2.2檸檬酸鈉上機(jī)稀釋液溶解殘留物，0.45 μm濾膜過濾，上機(jī)測定。

1.3.2.2 上機(jī)測定

梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

色譜柱：Na+磺基水楊酸柱（liquid chromatography under the limiting conditions of adsorptionL，CLCA）（K06/Na 4.6 mm×150 mm×7 μm）分離柱；流動相：緩沖溶液A為pH 3.4的檸檬酸鈉，緩沖溶液B為pH 10.8的檸檬酸鈉，再生液為氫氧化鈉溶液和茚三酮溶液，均按照廠家要求配制。檢測波長：570 nm；進(jìn)樣量：50 μL；緩沖泵流速：0.45 mL/min；試劑泵流速：0.25 mL/min；柱溫程序：初始柱溫 58 ℃；0～19.0 min，柱溫58℃；19.0 min～24.0 min，柱溫由58℃變化到74℃；24.0 min～49.0 min，柱溫 74 ℃；49.0 min～54.0 min，柱溫由74℃變化到58℃；54.0 min～59.0 min，柱溫58℃；反應(yīng)器溫度：130℃。

1.3.3 雪燕多糖提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 雪燕多糖提取單因素試驗

取處理好的雪燕粉，以料液比為1∶200（g/mL），選擇溶液pH值、提取時間和提取溫度3個因素進(jìn)行單因素試驗[18-21]。其中 pH 值設(shè)置為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；提取時間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h；提取溫度 20、30、40、50、60、70、80、90、100℃。加4倍體積的無水乙醇，即濃縮液∶無水乙醇為1∶4的體積比進(jìn)行沉淀，靜置過夜后8 000 r/min的條件下離心10 min，棄去上清，沉淀部分即為雪燕多糖。采用苯酚-硫酸法[20]測定多糖含量，并最終確定各單因素中的最佳提取參數(shù)。

1.3.3.2 雪燕多糖提取正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以多糖提取率為評價指標(biāo)，按L9（33）進(jìn)行正交試驗（表3），確定雪燕多糖最優(yōu)提取條件。

表3 L9（33）正交試驗因素與水平設(shè)計Table 3L9（33）Orthogonal experimental factors and level design

1.3.4 單糖組成成分分析

1.3.4.1 糖的衍生化

完全酸水解：取適量樣品于水解管中，加入4 mol/L三氟乙酸（trifluoroaceticacid，TFA）1 mL，于120℃烘箱中水解2 h。取出后，氮氣吹干。

衍生化反應(yīng)：向吹干后的樣品中加1 mL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 （PMP）-甲醇溶液以及0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，70℃水浴60 min，冷卻，加入0.5 mL 0.3 mol/L HCl溶液后，加入0.5 mL氯仿，振蕩搖勻后靜置20 min，棄去下層，萃取3次，取水層過膜上機(jī)。通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的比較，確定色譜峰所屬的化合物種類，通過峰面積計算各種化合物含量。

1.3.4.2 色譜條件

SHISEIDO C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：A為0.1 mol/L KH2PO4（pH 6.8）；B為乙腈；A∶B=82∶18（體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫為 25℃；進(jìn)樣量 10 μL；波長為 245 nm。

1.3.5 雪燕多糖體外抗氧化能力測定

1.3.5.1 羥自由基清除能力測定

取1 mL 0.2 mg/mL的雪燕多糖提取液，加入2.5 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液（樣液的空白組和陽性對照組的空白組加1 mL無水乙醇）和1 mL 8.8 mol/L的過氧化氫溶液置于離心管中混合均勻，37℃下反應(yīng)30 min，隨后在4 000 r/min條件下離心10 min，在510 nm處測量溶液上清液的吸光度。溶液樣品進(jìn)行3組平行，樣品對羥自由基的清除率按式（2）計算[22-23]。

式中：A為不加樣品組的吸光度（即用蒸餾水代替樣品）；B為試驗組的吸光度；B0為與試驗組對應(yīng)的空白組的吸光度。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力

將0.2 mL濃度為7.4 mmol/L ABTS溶液和0.2 mL濃度為2.6 mmol/L過硫酸鉀等體積混合。室溫黑暗條件下反應(yīng)12 h～16 h。得到ABTS工作液母液后用乙醇稀釋40倍～50倍，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液將該溶液在734 nm處吸光度調(diào)節(jié)為0.7～0.8之間，得到工作液備用。取0.1 mL 0.2 mg/mL的雪燕多糖提取液[24-25]，加入1.9 mL調(diào)配好的稀釋工作液，在37℃避光反應(yīng)1h后于734 nm下測定其吸光度。平行測定3次，取平均值。

式中：A對照為0.1mL乙醇+1.9 mL ABTS工作液的吸光度；A樣品為0.1 mL樣品+1.9 mL ABTS工作液的吸光度。

1.3.5.3 DPPH自由基清除能力測定

稱取一定量的DPPH試劑，用無水乙醇配制成0.2 mmol/L DPPH溶液。取0.2 mg/mL的雪燕多糖提取液2 mL+1 mL DPPH溶液（空白組用甲醇代替DPPH）混合均勻后在室溫黑暗處靜置30min，在517nm處測吸光度值。以抗壞血酸作為陽性對照，樣品對DPPH自由基的清除率按式（4）計算。

式中：A為不加樣品組的吸光度（即用蒸餾水代替樣品）；B為試驗組的吸光度；B0為與試驗組對應(yīng)的空白組的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較并進(jìn)行Duncan’s檢驗，P＜0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪燕中微量元素含量

電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）擁有低檢出限、寬動態(tài)線性范圍、干擾少、分析精密度高、分析速度快、可進(jìn)行多元素同時測定以及可提供精確的同位素信息等分析特性。采用該方法對雪燕中的微量元素進(jìn)行評價分析，結(jié)果如表4所示。

表4 微量元素測定結(jié)果Table 4 Trace element determination results

雪燕中鉛、鎘、砷均未檢出，鎳、鉻含量均符合國家安全標(biāo)準(zhǔn)限量，說明該雪燕產(chǎn)品安全性高，不存在重金屬超標(biāo)問題。同時雪燕中含有人體必需微量元素鍶、鈷、銅、鋅，以及元素鎳和錳。其中鍶（1.06×10-2g/100 g）、錳（2.87×10-3g/100 g）含量豐富，鍶是人體牙齒及骨骼的正常組成部分，在人體內(nèi)的代謝與鈣極為相似，能促進(jìn)骨骼的發(fā)育生長，在骨骼中，約占人體鍶總量的90%。缺鍶會引起齲齒、骨質(zhì)疏松、阻礙新陳代謝、產(chǎn)生牙齒和骨骼發(fā)育不正常等癥狀。而錳有促進(jìn)骨骼的正常生長和發(fā)育，維持正常的糖代謝和脂肪代謝，預(yù)防貧血和癌癥，維持正常腦功能等作用。

2.2 雪燕中氨基酸含量

雪燕中氨基酸含量見表5。

酸水解樣品后測定雪燕中氨基酸的種類豐富且較為齊全。共含有16種氨基酸，其中人體必需氨基酸含有 7 種 （Lys、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val），總量達(dá)21.1 g/100 g，占總氨基酸比例為42.93%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為43∶57。雪燕中天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）和谷氨酸（Glu）含量最為豐富，分別達(dá)到 9.28、7.01、5.49 g/100 g。

表5 雪燕中氨基酸含量Table 5 Amino acid content in tragacanth gum

天冬氨酸在雪燕中含量最高，占總氨基酸的18.5%，天冬氨酸對于高血壓、心臟病等疾病有較好的治療效果[26]。食品領(lǐng)域中可用來添加到保健食品中起到緩解疲勞的作用，在飲料配制時添加天冬氨酸，對口感和風(fēng)味有一定的提升[27]；化工領(lǐng)域中可作為高分子材料的原材料，也能夠作為營養(yǎng)添加劑添加到化妝品中[28]。

谷氨酸為雪燕中含量較高的氨基酸，占總氨基酸含量的11.09%，有助于蛋白質(zhì)的合成，參與腸道改善功能、提高腸道阻擋能力、使腸道細(xì)胞活性增強(qiáng)、促使腸道生長發(fā)育、提高抗氧化功能[29]。

2.3 多糖提取工藝優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 單因素試驗結(jié)果

2.3.1.1 提取溫度對雪燕多糖提取率的影響

溫度對雪燕多糖提取率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，雪燕多糖提取率呈先上升后下降的變化趨勢，當(dāng)提取溫度升至60℃時，多糖提取率達(dá)最大值（3.63%）。溫度較低時，多糖成分溶解速率緩慢，在相同時間內(nèi)多糖提取率較低；隨著溫度的升高，多糖溶解度提高，利于多糖的提??；但溫度過高易引起多糖水解或分子鏈破壞而生成小分子糖類物質(zhì)，使多糖含量下降，同時，溫度過高也會導(dǎo)致水氣化的出現(xiàn)，若水氣化現(xiàn)象持續(xù)時間較長，則會引起溶劑體積增大，料液比下降，影響多糖的溶出率，降低多糖的提取率[30]。因此，提取溫度為60℃時，雪燕多糖的提取效果最佳。

圖1 溫度對雪燕多糖提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharide from tragacanth gum

2.3.1.2 pH值對雪燕多糖提取率的影響

pH值對雪燕多糖提取率的影響見圖2。

圖2 pH值對雪燕多糖提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction rate of polysaccharide from tragacanth gum

結(jié)果如圖2所示，當(dāng)pH值為3.0時，雪燕多糖提取率最大（6.58%）。pH值較高與過低時，雪燕多糖提取率均較低，該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是酸環(huán)境和堿環(huán)境均導(dǎo)致了雪燕中的一些大分子多糖降解為小分子多糖，導(dǎo)致雪燕多糖的徹底溶解。因此，提取液pH 3為最適pH值。

2.3.1.3 提取時間對雪燕多糖提取率的影響

提取時間對雪燕多糖提取率的影響見圖3。

從圖3可以看出，提取時間對雪燕多糖提取率存在一定影響，從0.5 h開始隨著時間的增加呈上升趨勢，到達(dá)最高點后提取率又隨著時間的增加而下降。當(dāng)提取時間為3.0 h時，多糖的提取率最高（8.73%）。在酸性環(huán)境下提取時間過長會增加多糖的水解程度，影響其提取率。同時達(dá)到一定時間后，細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓逐步趨于平衡，多糖提取率不再上升，加熱狀態(tài)下過長的時間可能導(dǎo)致多糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使多糖提取得率下降[31]。

圖3 提取時間對雪燕多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide from tragacanth gum

2.3.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表6。

雪燕多糖提取率正交試驗所選3種因素的主次順序為：提取時間>提取溫度>pH值，即提取時間對雪燕多糖提取率影響最大，其次是提取溫度，最后為pH值。雪燕多糖的最佳提取工藝條件為：提取溫度60℃、pH 2.0、提取時間 3.5 h。

為驗證正交試驗工藝組合提取溫度60℃、pH 2.0、提取時間3.5 h，進(jìn)行3次平行驗證試驗。結(jié)果表明，在該組合工藝條件下，雪燕多糖平均提取率為13%，證明該正交試驗結(jié)果可靠準(zhǔn)確。

2.4 單糖組成成分分析

不同種類的單糖因在糖柱中的保留時間不同而依次出峰。在1.3.4測試條件下鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的液相譜圖見圖4，雪燕多糖水解液的液相色譜見圖5。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖PMP衍生物的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of a mixed standard monosaccharide PMP derivative

表6 正交試驗結(jié)果Table 6 Orthogonal test results

通過保留時間可對單糖進(jìn)行定性分析，在液相色譜圖中，峰面積與質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系，因此通過峰面積可對單糖進(jìn)行定量分析，雪燕多糖中的單糖組成成分主要是鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、它們的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為22.1%、20.0%、5.66%、1.64%。王森等[32]研究印度樹膠水解后可獲得L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-甘露糖和D-半乳糖醛酸，與本研究所得單糖組成有所不同，由此可得同一種類天然食用樹膠不同樹種（種源）之間，單糖含量不同。

2.5 體外抗氧化結(jié)果與分析

自由基（free radical，F(xiàn)R）是指帶有未成對電子的原子或基團(tuán)。機(jī)體在受到各種因素（環(huán)境溫度、機(jī)械、病原）的影響下會在短時間內(nèi)大量產(chǎn)生。機(jī)體內(nèi)大量自由基的產(chǎn)生是機(jī)體應(yīng)激、亞健康和文明病形成的主要原因。機(jī)體內(nèi)的自由基分為兩類：活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）?；钚匝酰≧OS）不僅包括氧中心自由基，而且包括氧的反應(yīng)衍生物的非自由基（如H2O2）。活性氮（RNS）是指氮自由基和其他反應(yīng)分子。在活性氧自由基中，·OH具有強(qiáng)氧化性和強(qiáng)反應(yīng)性?！H能損害與其緊密接觸的分子，是對生物物質(zhì)最具破壞性的ROS?！O是代表性的活性氮自由基，能結(jié)合過渡態(tài)金屬，·NO與Fe的結(jié)合是·NO發(fā)揮作用的重要機(jī)制，同時通過結(jié)合血紅蛋白中的鐵使其在失活和消除的過程中發(fā)揮重要作用。

圖5 雪燕多糖水解PMP衍生物的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of tragacanth gum polysaccharide hydrolyzed PMP derivative

本研究以抗壞血酸為陽性對照，采用ABTS+自由基清除法與DPPH法分析雪燕多糖體外清除活性氮自由基的抗氧化能力，同時以·OH為對象，評價了雪燕多糖對其清除能力。雪燕多糖體外抗氧化結(jié)果見圖6。

結(jié)果如圖6所示，雪燕多糖羥自由基清除能力與ABTS+自由基清除率分別為7.39%與4.34%，顯著低于陽性對照，說明雪燕多糖對·OH和ABTS+自由基的清除能力有限；與此相反，DPPH試驗中，雪燕多糖顯示了良好的抗氧化能力，DPPH自由基清除率為23.841%，其抗氧化效果均與陽性對照VC相似。說明雪燕多糖具有較高的清除氮自由基能力。多糖屬于高分子物質(zhì)，易溶于水，而不溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，即使在含有部分水的DPPH與ABTS工作溶液中，多糖也很容易析出，造成溶液渾濁[33]。因而本試驗僅對濃度為0.2 mg/mL的低濃度多糖溶液進(jìn)行了抗氧化試驗。

圖6 雪燕多糖體外抗氧化結(jié)果Fig.6 Antioxidant results of tragacanth gum polysaccharide in vitro

在蔡延渠等[24]、李鳳月等[25]的研究中證實了相同濃度下，與VC相比，桃膠多糖作用較弱，與本試驗結(jié)果中雪燕多糖羥自由基清除能力與ABTS+自由基清除率低于VC清除能力的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

雪燕作為一種新興的食品，具有較高的營養(yǎng)價值，含有豐富的微量元素和氨基酸，其中鍶、錳、天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）和谷氨酸（Glu）含量最為豐富。作為生物活性成分，雪燕多糖提取條件優(yōu)化將為雪燕產(chǎn)品開發(fā)提供重要依據(jù)，本研究確定雪燕多糖的最佳提取條件為提取溫度60℃、pH 2.0、提取時間3.5 h，多糖提取率可達(dá)13%。經(jīng)HPLC法分析測定，確定雪燕多糖中的單糖組成主要含有鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、巖藻糖，其中鼠李糖和半乳糖含量較高，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.1%、20.0%。提取的雪燕多糖具有一定的抗氧化能力，對活性氮自由基的清除能力較高。雪燕及雪燕多糖具有豐富的營養(yǎng)價值和生物學(xué)功能，是化妝品、保健食品和藥品領(lǐng)域的一種良好的天然營養(yǎng)食品及抗氧化劑，具有較高的研究與開發(fā)價值。