汝 晶 陳 嶸 鄭 梅 李明泓 張 珊

云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

胃癌是一種在全球范圍內(nèi)預(yù)后差、致死率高的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，大約90%的胃部腫瘤都屬于腺瘤[1]。一般認(rèn)為外科手術(shù)是對其進(jìn)行根治的唯一療法，同時輔以放化療。然而，由于早期胃癌的診斷率低，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)就是進(jìn)展期或晚期，錯過最佳的手術(shù)窗口期，增加胃癌的致死率[2]。目前在臨床上主要使用卡培他濱、順鉑、氟尿嘧啶等在內(nèi)的化療藥物進(jìn)行聯(lián)合治療。但化療藥物副作用明顯，且長期使用會損害機體的多個器官系統(tǒng)[3]。中藥具有良好的抗腫瘤活性，且毒副作用小。生物堿類是中藥有效成分中的重要組成之一，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等多種生物活性[4]。烏頭堿(aconitine)是存在于川烏、草烏、附子等藥用植物的一種生物堿。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，烏頭類中藥具有回陽救逆、溫陽散寒等療效；近些年臨床應(yīng)用和實驗研究表明，其在抗腫瘤、強心、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等方面具有特殊的功效。

烏頭堿對包括胃癌在內(nèi)的多種惡心腫瘤都具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及侵襲的作用[5-6]。將烏頭堿注射液稀釋后接種胃癌FC的615純系小鼠，結(jié)果顯示實驗組瘤重抑制率顯著高于對照組[7]；王冠庭[8]發(fā)現(xiàn)以烏頭堿注射液治療晚期胃癌患者，3個療程后，患者癥狀改善，梗阻癥狀消失。然而目前烏頭堿在臨床上的應(yīng)用卻受到限制，一方面是由于其使用劑量及毒性；另一方面則是其抗腫瘤作用機制的研究還十分有限。

miR-23a是定位于人19號染色體的一種非編碼微小RNA，與胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，被視為一個癌基因[9-11]。利用生物信息學(xué)方法(綜合TargetScan、MirBase兩個網(wǎng)站信息)預(yù)測出IRF1為miR-23a的可能靶基因，且已知報道m(xù)iR-23a在胃腺癌組織中高表達(dá)，并通過下調(diào)其下游靶蛋白干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)參與調(diào)節(jié)胃腺癌細(xì)胞的增殖[12-13]，兩者之間的靶定關(guān)系在肝癌細(xì)胞中也同樣存在[14]。而烏頭堿的抑癌作用是否與參與調(diào)節(jié)miR-23a及其通路相關(guān)，這一點仍需進(jìn)一步研究。本研究在細(xì)胞及分子水平，使用烏頭堿對細(xì)胞進(jìn)行處理，通過觀察細(xì)胞增殖與凋亡情況，檢測目標(biāo)基因及靶蛋白水平的變化，探討烏頭堿抗腫瘤作用miRNA水平的機制，為臨床上合理應(yīng)用烏頭堿治療胃癌提供相關(guān)的實驗基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 烏頭堿(批號BBP03866，云南西力生物有限公司)：取烏頭堿20.3 mg，加入1.015 mL三氯甲烷，配制成20 mg/mL的母液，然后按一定的比例分別稀釋成濃度為0、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL的稀釋液備用；三氯甲烷(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)；MTT(SIGMA,美國)；DMSO(SIGMA,美國)結(jié)晶紫(SIGMA,美國); 4%多聚甲醛(北京鼎國，北京)；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(Roche, 瑞士)；RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO, 美國)；胎牛血清(GIBCO, 美國)；IRF1抗體、GAPDH抗體(天津賽爾生物科技有限公司)；SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa, 日本)；Real-time PCR引物(miR-23a forward: 5′TGCGGATCACATTGCCAGGGATTTC3′及miR-23a-3p-Reverse:5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT3′；陰性對照U6 forward:5′TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC 3′及U6-Reverse: 5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 3′)購自昆明品品生物科技有限公司。

1.1.2 細(xì)胞株 胃腺癌細(xì)胞系MGC803購自天津賽爾生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 烏頭堿適宜作用濃度的篩選(MMT法) 將生長狀態(tài)良好的MGC803細(xì)胞接種于96孔板(細(xì)胞數(shù)約8×103個)，細(xì)胞完全貼壁后分別更換為濃度梯度稀釋的烏頭堿溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h，另設(shè)溶劑對照組；分別在0、24、48、72 h后，每孔加10 μL 濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；后終止培養(yǎng)并棄掉原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min；在酶聯(lián)免疫檢測儀上波長為490 nm處測出各孔的吸光度值進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。根據(jù)以下公式計算烏頭堿對MGC803細(xì)胞的存活率：(實驗組OD-空白對照OD)/(對照組OD-空白對照OD)]×100%。

1.2.2 集落形成實驗檢測腫瘤細(xì)胞增殖能力 收集對數(shù)期MGC803細(xì)胞，接種于12孔板中，設(shè)置對照組和實驗組(烏頭堿處理)，每孔細(xì)胞數(shù)約150個細(xì)胞，每組3個平行，培養(yǎng)24 h后，對照組每孔加入1 mL正常培養(yǎng)基，實驗組加入1 mL濃度為60 μg/mL的烏頭堿稀釋溶液，每3天換液1次，培養(yǎng)14 d；后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)每孔大于50個以上的集落數(shù)目，計算集落形成率。

1.2.3 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡水平 選取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)期的MGC803細(xì)胞，消化計數(shù)后接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，實驗組加入濃度為60 μg/mL的烏頭堿溶液1 mL，對照組不加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。后棄去原培養(yǎng)液，用PBS清洗兩遍，待細(xì)胞自然晾干后進(jìn)行樣本固定；樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后加入蛋白酶K滅活DNA、RNA，最后加入TUNEL液，恒溫箱中避光孵育60 min。把處理好的樣本PBS漂洗3次，每次5 min；用無菌雙蒸水將1 μg/mL DAPI染液儲存液稀釋1000倍，每孔加40 μL，室溫避光染色5 min。用無菌雙蒸水于室溫洗2次，5 min/次。熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光代表細(xì)胞凋亡，藍(lán)色熒光代表生存細(xì)胞。

1.2.4 Real-time RCR檢測miR-23a的表達(dá)水平 收集細(xì)胞樣本加入1 mL Trizol裂解，提取細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測量RNA濃度后，將合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到對應(yīng)的cDNA，miR-23a-RT:5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACGGAAAT3′。熒光實時定量PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL，包括cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、SYBRGREEN 10 μL，其余用ddH2O補齊。反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。正向引物序列：5′TGCGGATCACATTGCCAGGGATTTC3′，反向引物序列：5′ CCAGTGCAGGGTCCGAGGT3′。對照組U6正向引物序列：5′TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC 3′，反向引物序列：5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 3′。封閉miR-23a序列，ASO-23a序列為：5′GGAAATCCCTGGCAATGTGAT3′；ASO-NC序列為：5′CAGTACTTTTGTGTAGTACAA3′。

1.2.5 Western blot檢測IRF1蛋白的表達(dá)量 按照實驗組與對照組分別收集細(xì)胞，后加入RIPA裂解液對蛋白質(zhì)進(jìn)行抽提。配置10%的SDS-PAGE凝膠，將處理好的蛋白樣品取適量上樣，恒壓80 V電泳2.5 h，對目的蛋白進(jìn)行分離。后轉(zhuǎn)膜并用5%的脫脂奶粉溶液進(jìn)行封閉，然后一抗4 ℃結(jié)合過夜，1×TBST侵洗3次后加入二抗，室溫作用1.5 h。最后用Western LightningTMEnhanced Chemiluminescence Substrate檢測顯影，將曝光后進(jìn)行定影處理的膠片用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像，分析內(nèi)源性IRF1條帶的亮度值。

2 結(jié)果

2.1 烏頭堿抑制胃腺癌細(xì)胞MGC803的增殖 已知烏頭堿(圖1A)具有一定的細(xì)胞毒性[15]，為檢測其對胃腺癌細(xì)胞MGC803增殖的影響，首先將制備的烏頭堿母液(20 mg/mL)按一定的濃度梯度進(jìn)行稀釋(0、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL)，利用MMT實驗對不同濃度的烏頭堿溶液對細(xì)胞活性的影響進(jìn)行檢測，并計算存活率(圖1A)。如圖1B所示，烏頭堿對MGC803細(xì)胞體外增殖有著明顯的抑制作用，并且隨著作用濃度和作用時間的延長，其抑制作用增強，具有濃度和時間的依賴性。烏頭堿作用MGC803細(xì)胞48 h后應(yīng)用GraphPad Prism 5.0計算出的IC50值為(37.76±1.65)μg/mL，后續(xù)實驗中選擇40 μg/mL作為實驗組作用的藥物濃度。為進(jìn)一步證實烏頭堿抑制癌細(xì)胞增殖的作用，集落形成實驗顯示，與對照組比較實驗組細(xì)胞集落形成能力下降(圖1B)，且具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 烏頭堿可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制胃腺癌細(xì)胞增殖細(xì)胞 凋亡是細(xì)胞程序性死亡多種形式中研究最為深入的一種。細(xì)胞凋亡作為一種重要的細(xì)胞死亡形式，當(dāng)其發(fā)生失調(diào)時，可打破細(xì)胞生長與死亡之間的平衡，是腫瘤發(fā)生的重要機制之一[16]。為了明確烏頭堿在結(jié)果2.1中所表現(xiàn)出的抑癌作用是否與參與細(xì)胞凋亡有關(guān)，利用TUNEL實驗進(jìn)行檢測。如圖2A所示，烏頭堿處理組與對照組相比，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，凋亡指數(shù)顯示兩組存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(圖2B)。

2.3 烏頭堿下調(diào)內(nèi)源性miR-23a的表達(dá)間接上調(diào)其下游靶基因IRF1的水平 大量研究證實miR-23a在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演癌基因的角色。在胃腺癌細(xì)胞MGC803中，miR-23a可通過下調(diào)IRF1抑制細(xì)胞凋亡[13]。為了研究烏頭堿誘導(dǎo)MGC803發(fā)生細(xì)胞凋亡與miR-23a及其下游靶基因的關(guān)系，設(shè)置實驗組與對照組，通過Real-time PCR檢測烏頭堿對內(nèi)源性miR-23a表達(dá)的影響，以及利用Western blot檢測烏頭堿間接對miR-23a下游靶基因IRF1表達(dá)的影響。結(jié)果如圖3顯示，經(jīng)烏頭堿處理后，內(nèi)源性miR-23表達(dá)下調(diào)(圖3A)，同時IRF1表達(dá)上調(diào)(圖3B，3C)。這說明烏頭堿通可過參與調(diào)節(jié)miR-23a抑制細(xì)胞凋亡。

2.4 封閉內(nèi)源性miR-23a后經(jīng)烏頭堿處理細(xì)胞凋亡加強 為了進(jìn)一步明確烏頭堿誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)miR-23a的關(guān)系，通過反義miR-23a寡聚核苷酸封閉內(nèi)源性miR-23a，同時設(shè)置對照組進(jìn)行實驗。首先，對反義miR-23a寡聚核苷酸的有效性進(jìn)行檢測，同事發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ASO-23a后再經(jīng)烏頭堿處理，miR-23a的表達(dá)水平與對照組相比進(jìn)一步降低(圖4A)。將對照組(ASO-NC)及實驗組(ASO-23a)分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，5% CO2 孵箱37℃培養(yǎng)6h后對照組及實驗組加入烏頭堿稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)至48h利用TUNEL對細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4B、4C所示，首先不加藥時，轉(zhuǎn)染ASO-23a與轉(zhuǎn)染ASO-NC相比細(xì)胞凋亡水平升高，反向驗證miR-23a可抑制細(xì)胞凋亡；而封閉內(nèi)源性miR-23a后，加藥組與非加藥組相比，細(xì)胞凋亡明顯加強說明加藥后內(nèi)源性miR-23a表達(dá)的進(jìn)一步下降促進(jìn)細(xì)胞凋亡的進(jìn)一步發(fā)生，同時也提示烏頭堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與調(diào)節(jié)miR-23a以外的其他活動相關(guān)。

3 討論

烏頭類中藥具有很高的藥用價值，其活性成分中的一大類為烏頭類生物堿，烏頭堿即為其中一種。以近些年備受關(guān)注的miRNA作為切入點，研究中藥活性成分的作用機制具有重要意義。筆者從miRNA水平揭示了烏頭堿抑制胃腺癌細(xì)胞增殖的新機制，即烏頭堿可通過下調(diào)癌基因miR-23a的水平，間接上調(diào)其下游靶基因IRF1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞MGC803發(fā)生凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

已知報道m(xù)iR-23a及其下游多個靶基因均可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11,17-18]，那么烏頭堿抗胃癌作用的發(fā)揮除本文研究的IRF1以外是否與調(diào)節(jié)其他下游蛋白相關(guān)，從而實現(xiàn)一種網(wǎng)絡(luò)化調(diào)控，這一點仍需進(jìn)一步研究。值得注意的是，IRF1還可激活caspase1、caspase3、caspase7、以及caspase8[19-20]，而其他程序性細(xì)胞死亡形式也存在caspase依賴途徑，同時隨著近些年研究的深入，多種程序性細(xì)胞死亡形式之間的聯(lián)系被逐漸揭示，比如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、細(xì)胞鐵死亡等均可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時發(fā)生機制也有交叉[21]。有報道指出烏頭堿也可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬[22]，提示對中藥活性成分作用機制的研究可以從不同細(xì)胞死亡形式入手。另外，烏頭堿還具有抗感染及抗炎作用，幽門螺旋桿菌的感染與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切[23-24]，因此烏頭堿抑制胃癌的作用是否與抗感染及抗炎作用相關(guān)也值得進(jìn)一步思考。