吳碧清 吳賢倩 陳麗玄 鮑 杰 王 平

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤和胃腺癌發(fā)生的主要誘導(dǎo)因素之一[1]。幽門螺桿菌是世界范圍內(nèi)常見的、具有強傳染性的病原菌之一。有研究報道，全球有超過50%的人群感染此菌[2]。研究H.pylori致病機制，有效防治幽門螺桿菌相關(guān)性疾病已成為全球關(guān)注重大公共衛(wèi)生健康問題。由于現(xiàn)階段抗生素耐藥性的增加，幽門螺桿菌根除率逐年下降。探索幽門螺桿菌感染治療的新路徑是當前研究的熱點問題，其中中醫(yī)藥治療引起越來越多的關(guān)注。中醫(yī)藥治療幽門螺桿菌感染具有療效確切、毒副反應(yīng)小、根除率高等優(yōu)勢，是西藥療法的有益補充[3]。目前研究已發(fā)現(xiàn)多種中藥具有明確的抗幽門螺桿菌作用。

大果木姜子是樟科樟屬植物米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)的干燥成熟果實，味苦、辛，性溫，能夠散寒祛濕、行氣止痛，常用于治療胃痛、腹脹、腹痛、胸悶、嘔吐等病癥。主要分布在我國西南地區(qū)，如貴州、云南和廣西等省，為貴州十大苗藥之一[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，大果木姜子揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、表皮癬菌等具有較好的體外抑菌作用[7]。但目前尚未見其對幽門螺桿菌抑菌效果的相關(guān)報道。通過體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)大果木姜子揮發(fā)油對幽門螺桿菌有較強的抑菌作用，現(xiàn)將研究結(jié)果匯報如下。

1 儀器與材料

1.1 試驗菌株幽門螺桿菌 ATCC26695由貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室惠贈，由課題組保管于貴州中醫(yī)藥大學(xué)形態(tài)實驗室。

1.2 材料 大果木姜子購自貴陽市萬東藥材市場，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳曉蘭教授鑒定為正品。幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基(HB8647)、腦心浸液肉湯干粉(HB8297-1)、幽門螺桿菌抑制劑(HB8646a，10 mL/支)購自青島海博生物技術(shù)有限公司；無菌新鮮羊血購自貴陽超研生物科技有限公司；過氧化氫酶試劑(HB8650)、氧化酶試紙片(HB2100)購自于青島海博生物技術(shù)有限公司；尿素酶試紙(121102)購自珠海市克迪科學(xué)技術(shù)開發(fā)公司；氨芐西林藥敏紙片(AMP，10 ug)購自湖南長沙快邁生物科技有限公司；微需氧產(chǎn)氣袋(8057ZJ-2，日本三菱)購自上海舒濟生物有限公司。

1.3 儀器 ULTS1386超低溫冰箱(美國賽默飛世爾科技公司)，BSC-1300 ⅡA2生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，BNA610電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本Yamato公司)，GI54DWSGI60DP立式壓力蒸汽滅菌器(廈門致微儀器有限公司)，麥氏比濁儀(法國Biomerieux SA公司)，WND-2000高速中藥粉碎機(浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司)，多功能酶標儀(瑞士Tecan Spark)。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備 固體培養(yǎng)基(平板)的制備參照說明書，稱取幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基15.6 g，加入279 mL純水，高壓滅菌(121℃，20 min)處理，待瓊脂冷卻至50～55℃時，加入無菌脫纖維羊血21 mL、幽門螺桿菌抑制劑30 mL，混勻，傾倒于90 mm無菌平皿，培養(yǎng)基厚度約為3～4 mm，冷卻凝固后，4℃?zhèn)溆?。液體培養(yǎng)基制備，腦心浸液3.85 g，加無菌純水90 mL，高壓滅菌，冷卻后加10 mL胎牛血清，分裝，保存于4℃冰箱備用。

2.2 幽門螺桿菌鑒定 在微需氧環(huán)境中(培養(yǎng)罐中放置微需氧袋)培養(yǎng)幽門螺桿菌48～72 h，連續(xù)培養(yǎng)3代，通過觀察其菌落形態(tài)、生化試驗(氧化酶試驗、快速尿素酶試驗、過氧化氫酶試驗)以及革蘭染色進行鑒定。接種環(huán)滅菌后刮取平板中疑似菌落放于氧化酶試紙片或快速尿素酶試紙條上，30 s至2 min內(nèi)觀察結(jié)果。氧化酶試紙在 30 s 內(nèi)變?yōu)樗{色或藍紫色為強陽性，2 min內(nèi)不變色為陰性。快速尿素酶試紙在1～2 min內(nèi)變紅，則尿素酶試驗為陽性，如果試紙條顏色不變，則尿素酶試驗為陰性。過氧化氫酶試驗根據(jù)說明書操作，在平板中可疑菌落上滴加1滴3%過氧化氫，觀察有無氣泡產(chǎn)生，如有氣泡產(chǎn)生，判斷為陽性。

2.3 幽門螺桿菌菌懸液制備 無菌接種環(huán)從平板中上刮取菌落于無菌生理鹽水中稀釋成菌懸液，采用比濁法(麥氏比濁儀)調(diào)整菌懸液濃度為1.5×108cfu/mL。

2.4 大果木姜子揮發(fā)油提取 稱取大果木姜子50 g，加入三倍量水浸泡3 h后取出，在80 ℃烘干至恒重，粉碎成細粉備用；稱取大果木姜子細粉，置圓底燒瓶中，加入12倍量水，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間為8 h，計算得油率，得油率(%)=油狀液體體積/樣品重量×100%。提取得到的揮發(fā)油置冰箱保存。

2.5 含藥紙片的制備 用1% 二甲基亞砜(DMSO，以無菌去離子水為溶劑)將大果木姜子揮發(fā)油原液稀釋成100 mg/mL溶液，再按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80濃度梯度用1%DMSO進行稀釋，將滅菌后空白藥敏紙片分別置于不同濃度的大果木姜子油溶液中充分浸透后，放37 ℃溫箱內(nèi)過夜，取出置陰暗干燥處存放，備用。以1% DMSO作為空白對照，氨芐西林(AMP)藥敏紙片為陽性對照(10 μg/片)。

2.6 大果木姜子揮發(fā)油抑菌活性檢測

2.6.2 最低抑菌濃度(MIC)測定 按2.5方法用1%DMSO將揮發(fā)油稀釋至100 mg/mL，于96孔板中，用腦心浸液將藥液對倍稀釋。并將100 μL藥液與1.5×108cfu/L菌懸液100 μL混合，使揮發(fā)油終濃度為50、25、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL。設(shè)置腦心浸液對照(陰性對照)、細菌生長對照(陽性對照)及1%DMSO溶媒對照。每孔做3個平行孔。微孔板震蕩混勻后，放入?yún)捬豕拗屑尤胛⑿柩醮?，置?7℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果。肉眼觀察到無明顯渾濁的最高藥物稀釋度即為大果木姜子揮發(fā)油的最低抑菌濃度(MIC值)。同時，利用酶標儀快速檢測各孔在600nm處吸光值，測定細菌抑菌率(%)=[(陽性對照孔OD-陰性對照孔OD)-(藥物孔OD-陰性對照孔OD)]/(陽性對照孔OD-陰性對照孔OD)，與肉眼觀察獲得的MIC值進行核對，當抑菌率大于90%，可認定MIC值可靠，若抑菌率小于90%，則重新判定MIC值(初判定濃度的上一個稀釋梯度)，直至抑菌率符合判定標準[9-10]。

2.6.3 最低殺菌濃度(MBC)測定 按2.5.2方法在96孔板上將藥物倍比稀釋8個濃度后，與菌液混合，致藥物最終濃度為50、25、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL，吹打混勻，每孔各吸取100 ul接種于血瓊脂平板上，用涂布棒涂勻后置于37℃培養(yǎng)箱中微需氧培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果，未出現(xiàn)菌落生長的最小濃度為最低殺菌濃度。

3 結(jié)果

3.1 大果木姜子揮發(fā)油得油率 水蒸氣蒸餾法提取8 h，所得大果木姜子揮發(fā)油體積為3.2 mL，得油率為6.4%。

3.2 幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基上生長現(xiàn)象觀察及革蘭氏染色結(jié)果 在固體培養(yǎng)基上幽門螺桿菌菌落為直徑1～2 mm的透明針尖樣菌落，融合成片(圖1)。經(jīng)涂片、固定、革蘭染色后油鏡下觀察，革蘭染色陰性，呈弧形、海鷗狀彎曲或短桿狀(圖2)。氧化酶試驗、快速尿素酶試驗、過氧化氫酶試驗均為陽性。

3.3 抑菌活性測定

3.3.1 抑菌圈 通過測定抑菌圈直徑大小評價抑菌效果，結(jié)果見圖3和表1。結(jié)果顯示大果木姜子揮發(fā)油對幽門螺桿菌有較強的抑菌作用，陽性對照組及1∶10和1∶20藥物濃度組抑菌圈直徑均>15 mm；1∶40藥物濃度組抑菌圈直徑>6 mm，1∶80藥物濃度組和溶媒(1%DMSO)對照組無抑菌圈。

表1 大果木姜子揮發(fā)油對H. pylori的體外抑菌效果

3.3.2 MIC和MBC測定結(jié)果 在對照組中，腦心浸液對照組(陰性對照)液體澄清，細菌生長對照(陽性對照)有菌生長，1%DMSO溶媒對照組有菌生長，提示1%DMSO無明顯抑菌作用。表2示肉眼初測大果木姜子揮發(fā)油對幽門螺桿菌MIC值為6.25 mg/mL。表3示各濃度梯度藥物OD600 nm吸光值，表4為各濃度梯度下，大果木姜子揮發(fā)油抑菌率，結(jié)果顯示，藥物濃度為6.25 mg/mL時，抑菌率為90.63%，達到抑菌率判定藥物MIC的標準(≥90%)，因此，大果木姜子揮發(fā)油對幽門螺桿菌MIC值為6.25 mg/mL。由表5可知，藥物濃度為12.5 mg/mL時，培養(yǎng)基中未見幽門螺桿菌生長，大果木姜子揮發(fā)油對幽門螺桿菌MBC值為12.5 mg/mL。

表2 大果木姜子對H.pylori最低抑菌濃度

表3 各濃度梯度藥物OD600nm值

表4 各濃度梯度藥物孔對應(yīng)的抑菌率 (%)

表5 大果木姜子對H. pylori最低殺菌濃度

4 討論

幽門螺桿菌是一種能夠在胃中生存的革蘭陰性微需氧細菌。1982年Barry J Marshall和J Robin Warren第一次在體外發(fā)現(xiàn)了幽門螺桿菌的存在[11]?，F(xiàn)代研究表明，幽門螺桿菌感染是慢性胃炎、消化性潰瘍和胃腺癌發(fā)生的主要誘導(dǎo)因素之一。幽門螺桿菌已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列為第一類致癌原[12]。雖然大部分幽門螺桿菌感染者可能終身無癥狀，但10%感染者可發(fā)展為消化性潰瘍，不到1%可能發(fā)展為胃癌或粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤。因此，《幽門螺桿菌胃炎京東全球共識報告》推薦對所有幽門螺桿菌感染者進行根除治療，除非有抗衡方面考慮[13-14]。目前，西藥根除幽門螺桿菌療效受抗生素耐藥及不良反應(yīng)等因素的影響，臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用中藥或中西醫(yī)結(jié)合治療可顯著提高幽門螺桿菌根除率，在改善臨床癥狀、降低西藥副作用方面有顯著優(yōu)勢[15]。

幽門螺桿菌感染引起的慢性胃炎可以歸結(jié)于祖國醫(yī)學(xué)的“胃脘痛”，脾胃虛寒是其臨床證型之一，貴州苗族藥物心胃止痛膠囊(又名心胃丹膠囊)具有溫胃散寒、理氣止痛的功效。對于急、慢性胃炎、萎縮性胃炎、消化性潰瘍，胃脘疼痛，腹部脹滿，反酸嘔惡等有特殊療效，對胃脘疼痛等癥狀的改善效果尤為顯著[16]，大果木姜子是心胃止痛膠囊的主藥之一[17]。近年來，國內(nèi)學(xué)者對大果木姜子的活性成分及藥理作用進行了大量的研究，研究發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)油可能是藥理作用的主要成分之一。本實驗采用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法提取大果木姜子揮發(fā)油，得油率為6.4%。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，大果木姜子揮發(fā)油對幽門螺桿菌有較好的抑制作用，其抑菌圈直徑與氨芐西林類似，MIC和MBC值分別為6.25 mg/mL和12.5 mg/mL，與文獻報道的高度敏感的抗幽門螺桿菌中藥黃連的MIC和MBC值接近[18]。這可能是心胃止痛膠囊可以有效改善幽門螺桿菌相關(guān)胃炎癥狀的一個重要原因。大果木姜子抗幽門螺桿菌作用機理及物質(zhì)基礎(chǔ)值得進一步深入研究。