廉政君 常煒

肺癌是指起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，其發(fā)病機制與吸煙、電離輻射、大氣污染等因素密切相關(guān)。由于肺癌發(fā)病初期臨床特征并不明顯，常被忽視或誤診，且目前治療手段有限，導(dǎo)致近年來肺癌患者的死亡率呈逐年升高趨勢[1-6]。JAK/STAT信號通路是細胞發(fā)育、生長、增殖等生理活動不可缺少的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究表明，腫瘤及心血管損傷等多種疾病的發(fā)病機制與JAK/STAT信號通路的異常表達有關(guān)[7-10]。近年來研究表明，肺癌的發(fā)病機制與JAK/STAT信號通路及其相關(guān)蛋白的異常激活密切相關(guān)[11-13]。漢黃芩素是從中藥材黃芩中提取分離得到的單體化合物，研究表明其具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[14-17]，而漢黃芩素對于肺癌A549細胞JAK/STAT信號通路及其細胞周期的影響目前尚未見報道。本文通過研究漢黃芩素對肺癌A549細胞凋亡、周期及對JAK/STAT信號通路的調(diào)節(jié)作用，以期為肺癌的臨床治療提供新的參考和依據(jù)。

資料與方法

一、材料

肺癌A549細胞購自中科院上海細胞庫；漢黃芩素購自成都曼思特生物科技有限公司；JAK2、STAT3和GAPDH抗體均購自Proteintech公司；細胞凋亡檢測試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒購自Promega公司；Matrigel基質(zhì)膠購自北京索萊寶科技有限公司；流式細胞儀購自北京島津公司；雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

二、 細胞培養(yǎng)與傳代

從-80℃冰箱中取出A549細胞凍存管，于37℃恒溫水浴箱輕輕搖動，溶解后移至超凈工作臺，用移液槍吸出管內(nèi)細胞懸液，轉(zhuǎn)移至10 mL無菌離心管中，加入適量的DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，800 r/min條件下離心5 min。棄去上清，加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打使細胞重懸，并小心接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換新鮮培養(yǎng)液，待細胞生長融合至70%～80%進行傳代。

三、 MTT法檢測細胞增殖能力

在96孔板上分別設(shè)置漢黃芩素低、中、高劑量組、對照組及調(diào)零組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。調(diào)零組只加入等量培養(yǎng)液，不加入細胞懸液，其余各組加入對數(shù)生長期的A549細胞，并使其密度為1×104個/mL。各組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后對照組及調(diào)零組更換新鮮培養(yǎng)液，漢黃芩素低、中、高劑量組分別加入終濃度為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的漢黃芩素，并繼續(xù)于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在避光的環(huán)境下每孔加入20μl MTT溶液(5 mg/mL)，于培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，然后輕輕吸去上清液，每孔加入150μlDMSO，置于振蕩器上震蕩5 min至藍紫色結(jié)晶完全溶解后于酶標儀490nm處測定OD值。按照如下公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率=1-[漢黃芩素各劑量組(OD均值)-調(diào)零組(OD均值)]/[對照組(OD均值)-調(diào)零組(OD均值)]×100%。

四、實時定量PCR檢測各組肺癌A549細胞中JAK2、STAT3 mRNA水平

取對照組及20、40、80 μmol/L的漢黃芩素作用48 h的A549細胞，采用RNA提取試劑盒，分別提取各組肺癌A549細胞的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，實時定量PCR檢測各組A549細胞中GAPDH、JAK2、STAT3 mRNA水平。各檢測基因的實時定量PCR引物(見表1)，實時定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

表1 用于實時定量PCR檢測的基因引物序列

五、AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測漢黃芩素對肺癌A549細胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期的A549細胞，調(diào)整細胞密度成1×104個/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，對照組加入新鮮培養(yǎng)基，漢黃芩素各劑量組分別加入終濃度為20、40、80 μmol/L的漢黃芩素，然后將6孔細胞培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h后，使用PBS洗滌細胞，加入適量不含EDTA的胰酶消化收集細胞并以1000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)基重懸細胞后，以2000 rpm離心5 min，棄上清液，加入195μl AnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，再加入5μl的AnnexinV-FITC混勻后，避光，室溫(20～25℃)孵育15 min，然后加入10μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，用流式細胞儀檢測各組A549細胞凋亡情況。

六、流式細胞術(shù)檢測漢黃芩素對A549細胞周期的影響

取對數(shù)生長期的A549細胞接種于6孔板，調(diào)節(jié)細胞密度為1×104個/孔，培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，對照組加入新鮮培養(yǎng)基，漢黃芩素各劑量組分別加入終濃度為20、40、80μmol/L的漢黃芩素，各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組A549細胞，，用1×PBS洗2遍后去除PBS，加入預(yù)冷的70%乙醇固定，過夜。次日取出，離心(2500 rpm，5 min，4℃)，用移液槍吸去上清液，渦旋震蕩使A549細胞松散。用1×PBS洗滌A549細胞兩次，然后加入已配好的碘化丙啶染色液，37°C染色30 min后，利用流式細胞儀，進行細胞周期檢測。

七、Western blot檢測漢黃芩素對A549細胞PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3水平的影響

取對數(shù)生長期的A549細胞接種于6孔板，調(diào)節(jié)細胞密度為1×104個/孔，培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，對照組加入新鮮培養(yǎng)基，漢黃芩素各劑量組分別加入終濃度為20、40、80μmol/L的漢黃芩素，各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組A549細胞，分別加入裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取50μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h后，經(jīng)PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3及GAPDH抗體(1:1000)孵育，4℃過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1:2000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進行灰度值檢測。

八、數(shù)據(jù)處理

結(jié) 果

一、漢黃芩素對肺癌A549細胞的增殖抑制作用

各組肺癌A549細胞的增殖抑制率(見表2)。結(jié)果表明，與對照組相比，漢黃芩素低、中、高劑量組肺癌A549細胞24 h、48 h、72 h的增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，且隨著漢黃芩素劑量的增加及作用時間的延長，漢黃芩素對A549細胞的增殖抑制率逐漸升高，提示漢黃芩素能夠呈劑量及時間依賴性的顯著抑制肺癌A549細胞的增殖。同時，漢黃芩素作用于肺癌A549細胞48 h后即可顯著抑制A549細胞的增殖(P<0.05)，故選擇漢黃芩素作用于肺癌A549細胞48 h進行后續(xù)實驗。

表2 各組肺癌A549細胞的增殖抑制率

二、漢黃芩素對肺癌A549細胞JAK2、STAT3mRNA水平的影響

各組肺癌A549細胞JAK2、STAT3mRNA水平(見圖1)。結(jié)果表明，與對照組相比，漢黃芩素低、中、高劑量組A549細胞JAK2、STAT3mRNA水平均顯著降低(P<0.05)，且肺癌A549細胞JAK2、STAT3mRNA水平隨漢黃芩素劑量的增加而逐漸降低。

圖1 各組肺癌A549細胞JAK2、STAT3mRNA水平

三、漢黃芩素對肺癌A549細胞凋亡的影響

各組肺癌A549細胞凋亡檢測結(jié)果(見圖2)。結(jié)果表明，與對照組相比，漢黃芩素低、中、高劑量組A549細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，同時，隨著漢黃芩素劑量的增加，肺癌A549細胞凋亡率逐漸升高，即表現(xiàn)出劑量依賴性。

四、漢黃芩素對肺癌A549細胞周期的影響

各組肺癌A549細胞周期檢測結(jié)果(見圖3)。結(jié)果表明，與對照組相比，漢黃芩素低、中、高劑量組G2/M期A549細胞比例顯著升高(P<0.05)，且G2/M期肺癌A549細胞比例隨著漢黃芩素劑量的增加而逐漸升高。

五、漢黃芩素對肺癌A549細胞PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3水平的影響

各組肺癌A549細胞PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3水平JAK2、STAT3水平見圖4。結(jié)果表明，與對照組相比，漢黃芩素各劑量組肺癌A549細胞Chk1水平不存在顯著性差異(P>0.05)，p-Chk1、P53、Bax水平顯著升高(P<0.05)， CyclinB1、PCNA、Bcl-2、Survivin、JAK2、STAT3水平均顯著降低(P<0.05)，且隨著漢黃芩素劑量的增加，肺癌A549細胞p-Chk1、P53、Bax水平逐漸升高，CyclinB1、PCNA、Bcl-2、Survivin、JAK2、STAT3水平逐漸降低(見圖4)。

圖2 各組肺癌A549細胞凋亡檢測結(jié)果 注：與對照組相比，*P<0.05。

圖3 各組肺癌A549細胞周期檢測結(jié)果 注：與對照組相比，*P<0.05。

圖4 各組肺癌A549細胞PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3水平、JAK2、STAT3水平

討 論

肺癌是臨床常見的發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。近年來，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，研究表明，肺癌的發(fā)病機制與年齡、性別、職業(yè)、大氣污染等多種因素密切相關(guān)[1-3]。由于肺癌存在直接擴散、血行轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移等多種播散轉(zhuǎn)移途徑，這給肺癌的治療增加了難度，目前臨床上對于肺癌的治療，主要采用放療、化療及免疫治療等手段[4-6]，但由于這些治療手段存在不良反應(yīng)大、易出現(xiàn)耐藥等多種缺點，對于治療肺癌藥物的研發(fā)仍是當前的工作重點之一。

JAK/STAT信號通路是與細胞生長、增殖等生理活動及功能密切相關(guān)的重要信號通路之一。研究表明，JAK/STAT信號通路的異常表達與胃癌、心肌損傷及神經(jīng)損傷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-10]。近年來，研究表明JAK/STAT信號通路在肺癌的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，同時抑制肺癌細胞JAK/STAT信號通路及相關(guān)蛋白的過度激活，能夠抑制肺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲，誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡[11-13]。

漢黃芩素是從傳統(tǒng)中藥材黃芩中提取得到的單體化合物，研究表明，其具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、血管保護等多種藥理作用[14-15]。有文獻報道，漢黃芩素能夠顯著抑制肺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[16-17]，但其對肺癌A549細胞JAK/STAT信號通路、細胞周期及凋亡的影響，目前尚未見報道。

本文通過研究不同濃度的漢黃芩素對肺癌A549細胞的增殖、凋亡、遷移及細胞周期的影響。PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin是與細胞凋亡相關(guān)的蛋白，PCNA在啟動細胞增殖的生命過程中起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標，Bax是促凋亡基因，Bcl-2是抗凋亡基因，Survivin能夠抑制下游凋亡相關(guān)基因的表達，起抗凋亡作用。結(jié)果表明，與對照組相比，漢黃芩素各劑量組肺癌A549細胞24 h、48、72 h增殖抑制率顯著升高，且表現(xiàn)出劑量及時間依賴性，提示漢黃芩素能夠呈劑量及時間依賴性的顯著抑制肺癌A549細胞的增殖，同時結(jié)果表明，不同濃度的漢黃芩素作用于肺癌A549細胞48 h后，漢黃芩素各劑量組肺癌A549細胞，凋亡率顯著升高，A549細胞遷移率及凋亡率且隨著漢黃芩素劑量的增加而變化，A549細胞Bax 水平顯著升高，PCNA、、Bcl-2、Survivin水平顯著降低，表明漢黃芩素能夠促進A549細胞促凋亡基因的表達，抑制抗凋亡基因的表達，進而發(fā)揮其促凋亡作用；Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1是調(diào)節(jié)細胞分裂周期的基因，Chk1通過磷酸化的方式阻斷細胞有絲分裂，P53作為抑癌基因，能夠抑制下游CyclinB1基因的表達，進而誘導(dǎo)細胞G2/M期阻滯，發(fā)揮抑制腫瘤細胞分裂的功能。本實驗結(jié)果表明，漢黃芩素各劑量組A549細胞G2/M期比例顯著升高，漢黃芩素各劑量組A549細胞Chk1水平無明顯差異，而p-Chk1及P53水平顯著升高，CyclinB1水平顯著降低，提示漢黃芩素能夠呈劑量依賴性的促進A549細胞Chk1蛋白的磷酸化，進而抑制細胞分裂，同時促進抗癌基因P53的表達，抑制其下游CyclinB1基因的表達，干擾A549細胞正常分裂周期，誘導(dǎo)肺癌A549細胞G2/M期阻滯，進而抑制A549細胞增殖，促進其凋亡；實時定量PCR實驗及Western blot結(jié)果表明，漢黃芩素各劑量組A549細胞JAK2及STAT3 mRNA水平、JAK2及STAT3水平均隨著漢黃芩素劑量的增加而逐漸降低，且與對照組相比，漢黃芩素各劑量組A549細胞JAK2及STAT3 mRNA水平、JAK2及STAT3水平均顯著降低，表明漢黃芩素能夠呈劑量依賴性的降低肺癌A549細胞JAK2及STAT3水平，抑制JAK/STAT信號通路的異常激活。

綜上所述，漢黃芩素能夠抑制肺癌A549細胞的增殖及遷移能力，誘導(dǎo)肺癌A549細胞凋亡及G2/M周期阻滯，其機制可能與調(diào)節(jié)JAK/STAT信號通路有關(guān)。