趙軍喜 康征 李鵬 宋小雪 杜錦龍 李強(qiáng)如

肺癌是最常見(jiàn)的呼吸道惡性腫瘤，分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的85%[1]。大多數(shù)NSCLC患者確診時(shí)已處于晚期階段或有局部轉(zhuǎn)移，盡管治療NSCLC的臨床試驗(yàn)有所進(jìn)展，但患者的5年存活率僅有15%[2]。尋找準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者預(yù)后的生物標(biāo)記物，提高患者的生存率具有重要的臨床價(jià)值。CD63為四跨膜蛋白家族中的一員，為一種腫瘤抑制因子，參與許多生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附、遷移和分化，CD63敲低后通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲[3-4]。目前已有研究顯示，CD63在舌鱗狀細(xì)胞癌、食管癌和腎癌中表達(dá)水平降低[3，5-6]。CD63在NSCLC中的研究較少，本文通過(guò)檢測(cè)NSCLC組織中CD63的表達(dá)水平，進(jìn)一步分析CD63的表達(dá)對(duì)患者的臨床特征和預(yù)后的影響。

資料與方法

一、一般資料

收集2013年6月-2015年1月在安陽(yáng)市第二人民醫(yī)院接受根治手術(shù)的NSCLC患者126例，男性102例，女性24例，年齡35～72歲，術(shù)后行輔助化療，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，例如長(zhǎng)春瑞濱+順鉑、紫杉醇+順鉑、依托泊苷+順鉑。收集患者的腫瘤組織標(biāo)本，制作成石蠟切片保存。收集患者的一般臨床資料包括：年齡、性別、吸煙史、腫瘤類型、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和手術(shù)方式。治療結(jié)束后第1年之內(nèi)每3個(gè)月復(fù)查1次，第2年和第3年每6個(gè)月復(fù)查1次，第4年之后每年復(fù)查1次。隨訪時(shí)間5-60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間38個(gè)月，失訪4例，失訪率為3.2%。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者同意并簽署知情同意書(shū)。

二、方法

免疫組化檢測(cè)：石蠟切片置于60 ℃烘箱中30 min，室溫放涼后置于二甲苯中脫蠟，然后將玻片依次置于梯度酒精中水化，最后用PBS沖洗。取一定量EDTA緩沖液加入耐高溫微波盒中，將組織切片置于配套的塑料玻片架上，放入緩沖液中加熱。室溫自然冷卻，從緩沖液中取出玻片用PBS沖洗。吸水紙將組織周?chē)嘤嗨治?，每張玻片?00 μl 5% BSA室溫封閉30 min。直接吸去切片上多余的BSA液體，每張切片加20ul稀釋的CD63一抗(1 ∶1 000)，置于濕盒中，4℃冰箱孵育過(guò)夜。從冰箱中取出濕盒，室溫復(fù)溫10 min，用PBS沖洗3次，每次5 min。吸去組織周?chē)嘤嗨?，每張切片?0 ul相應(yīng)種屬二抗(1 ∶4 000)，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3次，每次5 min。每張切片加100 ul新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下觀察組織顏色變化，出現(xiàn)棕褐色時(shí)立即將切片置于自來(lái)水中終止顯色。蘇木素滴加于切片組織上，30 s后置于自來(lái)水中終止顯色。1%鹽酸酒精中分化3-5 s，自來(lái)水沖洗10 min返藍(lán)(避免直接沖刷組織)，切片經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，通風(fēng)櫥中晾干，顯微鏡下觀察。H-score分?jǐn)?shù)= 3×強(qiáng)烈百分比染色的細(xì)胞+2×中度染色的百分比細(xì)胞+弱染色細(xì)胞的百分比。將H-score分?jǐn)?shù)≤100定義為CD63低表達(dá)，H-score分?jǐn)?shù)>100定義為CD63高表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以%形式表示，采用卡方檢驗(yàn)，Kaplan-Meier分析方法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較患者生存率，單因素及多因素Cox回歸模型分析影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 CD63在NSCLC組織中的表達(dá)情況

CD63在鱗狀細(xì)胞癌中43例高表達(dá)，35例低表達(dá)，腺癌中22例高表達(dá)，18例低表達(dá)，在其它類型組織中5例高表達(dá)，3例低表達(dá)，CD63的高表達(dá)率為55.6%(70/126)，低表達(dá)率為44.4%(56/126)。

二、CD63的表達(dá)水平對(duì)患者臨床特征的影響

CD63高表達(dá)組與低表達(dá)組之間患者的年齡、性別、吸煙史和組織類型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 CD63的表達(dá)水平對(duì)患者臨床特征的影響

三、CD63的表達(dá)水平對(duì)患者5年生存率的影響

CD63低表達(dá)組中位生存時(shí)間為48.5個(gè)月，5年P(guān)FS為23.2%(13/56)，CD63高表達(dá)組，中位生存時(shí)間為58.4個(gè)月，PFS為47.1%(33/70)。CD63低表達(dá)組5年總存活率、中位生存時(shí)間和PFS均低于CD63高表達(dá)組。

圖1 CD63在NSCLC組織中的表達(dá)情況(×200)

四、單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示，NSCLC患者DFS和OS與患者年齡、性別、吸煙、組織類型無(wú)關(guān)，而與患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和CD63的表達(dá)水平有關(guān)。將上述預(yù)后相關(guān)因素代入多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，NSCLC患者DFS和OS與患者腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和CD63的表達(dá)水平有關(guān)。腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期和CD63低表達(dá)均為NSCLC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

圖2 CD63的表達(dá)水平對(duì)患者5年生存率的影響

表2 單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

表3 單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

討 論

CD63是跨膜4種超家族蛋白(TM4SFP)被稱為四跨膜蛋白中的具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用的基因成員，是一種溶酶體膜黏附蛋白[7]。有研究顯示CD63在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和運(yùn)動(dòng)具有一定影響，但在體外對(duì)細(xì)胞則無(wú)此作用，提示CD63在體內(nèi)可能與某種配體相結(jié)合發(fā)揮作用[8-9]。CD63在腫瘤中研究較為廣泛，Kaprio等[10]研究顯示，CD63的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者腫瘤分期、分化程度和粘液組織學(xué)類型有關(guān)，CD63表達(dá)缺失后可誘導(dǎo)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化，為結(jié)直腸癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。CD63在胰腺腫瘤原發(fā)灶中的表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)移部位，且CD63低表達(dá)患者的PFS和OS顯著降低[11]。夏志軍等[12]研究顯示，CD63在卵巢癌中的表達(dá)水平降低，在晚期卵巢癌、早期卵巢癌和良性卵巢病變中的表達(dá)水平不同，與卵巢癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。

在本研究中共收集126例NSCLC患者，在NSCLC組織中CD63的高表達(dá)率為55.6%，低表達(dá)率為44.4%，且在較高的腫瘤分期和TNM分期中，CD63低表達(dá)組患者所占的比例較高。CD63的表達(dá)水平降低后，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用減弱，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。在淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的患者中CD63低表達(dá)組患者所占比例顯著高于CD63高表達(dá)組，說(shuō)明CD63的水平降低可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。有研究顯示CD63的表達(dá)降低可導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，并降低患者生存率[13-14]。在本研究中，CD63低表達(dá)組患者的5年中位生存時(shí)間和PFS均顯著低于CD63高表達(dá)組，經(jīng)過(guò)單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型回歸分析結(jié)果顯示，CD63低表達(dá)為患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。綜上所述，CD63低表達(dá)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有可能成為評(píng)估NSCLC預(yù)后的重要因子。