鐘 琦，黃志鑫 ，陳曉舟

(1.云南民族大學(xué) 數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)學(xué)院, 云南昆明 650500;2.常州大學(xué) 華羅庚學(xué)院, 江蘇 常州 213100)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2 )屬于β屬的新型冠狀病毒,它具有包膜,顆粒呈圓形,或者是橢圓形,并且為多形型.由新型冠狀病毒引起的新型冠狀病毒肺炎于2020 年2 月11 日被世界衛(wèi)生組織正式命名為:2019 冠狀病毒病(COVID-19, 即corona virus disease 2019).COVID-19 傳播速度極快, 傳播能力極強(qiáng), 到目前為止, 已經(jīng)導(dǎo)致了全世界多個(gè)地區(qū)數(shù)百萬的確診病例以及數(shù)十萬的死亡人數(shù), 對(duì)全世界人民的健康都構(gòu)成了巨大威脅. 核衣殼蛋白(nuclocapsid protein) 即N 蛋白, 通過N 基因來參與編碼的過程, 是冠狀的病原體刺激內(nèi)體從而產(chǎn)生抗體的蛋白, 這種蛋白對(duì)于醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域均具有診斷的價(jià)值. 它與病毒基因組RNA 相互纏結(jié)形成病毒核衣殼, 非常關(guān)鍵地對(duì)病毒核糖核苷酸的形成過程起了作用. 且N 蛋白相對(duì)比較保守, 所在SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)蛋白中占到最大比例, 且研究抗原檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，患上SARS后，從初期病狀發(fā)生即可在患者血清中檢測(cè)到核衣殼蛋白，而SARS的全基因組序列又與SARS-CoV-2的高度同源.因此, 研究分析SARS-CoV-2 N 蛋白的結(jié)構(gòu)有很重要的意義.

美國國家生物信息中心(national center for biotechnology information, NCBI), NCBI 的網(wǎng)址為:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.NCBI 主要包括了很多與生物醫(yī)學(xué)與技術(shù)有關(guān)的開源數(shù)據(jù)庫, 其首頁展示了諸如化學(xué)和生物分析(chemicals & bioassays), 數(shù)據(jù)和軟件(data & software), 基因表達(dá)(genes & expression), 蛋白質(zhì)(proteins) 以及分類學(xué)(taxonomy) 等資源, 而我們所需要的SARS-CoV-2 核衣殼蛋白序列就是源于NCBI 數(shù)據(jù)庫.

在研究SARS-CoV-2 N 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)方面,秦照玲等[1]對(duì)成功表達(dá)、純化出SARS-CoV-2 N重組蛋白的研究,為提出SARS-CoV-2的快速診斷方法以及開展SARS-CoV-2 N蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ). 秦小波等[2]應(yīng)用ExPASy 服務(wù)器上的SOPMA、GOR 兩個(gè)在線工具預(yù)測(cè)N 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)這兩種工具對(duì)SARS-CoV-2 N 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)有較好的一致性, 以無規(guī)卷曲為主. 并且這篇文章也是2020 年6 月17 日《生物學(xué)雜志》網(wǎng)絡(luò)首發(fā)的對(duì)新冠病毒N 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的論文. 由于本文主要也針對(duì)新冠病毒N蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)做預(yù)測(cè), 但是差異在于我們是采用深度學(xué)習(xí)的方法來做N 蛋白的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè), 具有創(chuàng)新性, 結(jié)果準(zhǔn)確并取得了較高的蛋白質(zhì)8類二級(jí)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確度為70%.在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)研究方面,王蕾蕾等[3]提出了1種新的算法模型卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Convolution neural network 即CNN), 分類層采用Softmax, 這個(gè)算法模型即CNN-Softmax 對(duì)CNN 的層次架構(gòu)進(jìn)行了改進(jìn), 每層卷積后都加入了ReLU 激活層以便優(yōu)化梯度消失的問題, 通過提取特征后輸入Softmax 分類器, 在25PDB 數(shù)據(jù)集上提高了3類二級(jí)結(jié)構(gòu)的正確率, 準(zhǔn)確率為78.38%. 針對(duì)同樣采用CNN的算法模型，我們的模型與之不同在于我們采用了3層的全連接層，通過第1、2層的RELU函數(shù)進(jìn)行通道降維在連接第3層的Softmax函數(shù)進(jìn)行8類二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，我們的方法速度快，最后生成一個(gè)分類向量，結(jié)果清晰可見，一目了然，能對(duì)N蛋白的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)做出準(zhǔn)確預(yù)測(cè).謝尚欣等[4]提出了1種用CNN對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行特征提取,然后使用模糊支持向量分類機(jī)(fuzzy support vector classifiers)來分類的名為CNN-FSVM 的算法,3類二級(jí)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確率也達(dá)到了83.6%.張帥燕等[5]提出一種新的基團(tuán)編碼方式將基團(tuán)編碼與位點(diǎn)特異性打分矩陣(Position-specific scoring matrix 即PSSM)的組合矩陣提取蛋白質(zhì)序列特征后再送入貝葉斯分類器中進(jìn)行分類預(yù)測(cè), 獲得了73.19% 的3類二級(jí)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確率.運(yùn)用深度學(xué)習(xí)的方法來對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的例子很多，但本研究卻做出了既在使用深度學(xué)習(xí)方法的同時(shí)又能對(duì)研究某種單一蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)做出準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，這為后者利用深度學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)某種單一蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)提出了可能，也有利于新型冠狀病毒的診斷.

1 利用MAFFT 對(duì)SARS-CoV-2 N 蛋白與SARS-CoV N 蛋白做序列比對(duì)分析

1.1 數(shù)據(jù)來源

從NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取SARS-CoV-2 N 蛋白與SARS-CoV N 蛋白的氨基酸序列, SARS-CoV-2 N 蛋白序列編號(hào)為(QHO62115.1), SARS-CoV N 蛋白序列編號(hào)為(AAP41047.1).

1.2 序列比對(duì)分析

在文獻(xiàn)[6]中介紹MAFFT 工具(www. ebi. ac. uk/ Tools/ msa/ mafft) 是1種非?？焖俚亩嘈蛄斜葘?duì)工具, 這種工具是基于快速傅里葉變換的方法進(jìn)行多重對(duì)比, 其顯著特點(diǎn)是速度快, 尤其對(duì)于高度保守的序列更為明顯. 我們使用該工具對(duì)SARS-CoV-2 N 蛋白與SARS-CoV N蛋白的氨基酸序列做了比對(duì), 得到結(jié)果如表1所示:

對(duì)表1進(jìn)行結(jié)果分析: 源于NCBI 數(shù)據(jù)庫可知, SARS-CoV-2 N 的序列長度為419 個(gè)氨基酸殘基, SARS-CoV N 的序列長度為422 個(gè)氨基酸殘基. 由表1 可以發(fā)現(xiàn), 2條序列以位點(diǎn)一致為主, 氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示相似性高達(dá)90.5%, 具有高度同源.此結(jié)果提示我們, SARS-CoV N 蛋白的研究成果可用作COVID-19 的疾病診斷和疫苗開發(fā)的參考依據(jù).

2 利用在線工具預(yù)測(cè)SARS-CoV N 蛋白的理化性質(zhì)與疏水性

2.1 利用在線工具軟件ProtParam 預(yù)測(cè)SARS-CoV-2 N 蛋白理化性質(zhì)

我們通過ExPASy 的ProtParam 在線工具(https://web.expasy.org/protparam/) 預(yù)測(cè)得到, SARS-CoV-2 N 蛋白由419 個(gè)氨基酸殘基組成, 氨基酸組成成分如表2 所示.

通過ProtParam 分析表明, 天冬氨酸和谷氨酸是附負(fù)電荷的氨基酸殘基, 總數(shù)是36 個(gè), 附正電荷的氨基酸殘基總數(shù)是60 個(gè), 等電點(diǎn)的理論值為10.07, 從蛋白質(zhì)的酸堿性看它屬于堿性; 測(cè)定了N 蛋白的原子結(jié)構(gòu)顯示, 共由 6 351 個(gè)原子組成, 相對(duì)分子質(zhì)量為:45 625.70, 化學(xué)分子式為C1971H3137N607O629S7. 不穩(wěn)定系數(shù)為55.09, 40 為此系數(shù)的臨界值, 55.09>40 表明SARS-CoV-2 N 蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白. 測(cè)定結(jié)果表明SARS-CoV-2 N 蛋白氨基端可能為甲硫氨酸(Met).

表2 SARS-CoV-2 N蛋白氨基酸組成信息

2.2 利用在線工具軟件ProtScale 預(yù)測(cè)新型冠狀病毒核衣殼蛋白疏水性

我們利用ExPASy 的ProtScale 在線工具(https://web.expasy.org/protscale/) 預(yù)測(cè)得到SARS-CoV-2 N 蛋白的疏水性, 由ProtParam 分析結(jié)果表明可知, 文獻(xiàn)[7]介紹脂肪族氨基酸指數(shù)(Aliphatic index 即AI)指蛋白質(zhì)中脂肪側(cè)鏈的相對(duì)占有量, 介紹總平均親水性(Grand average of hydrapathicity 即GRAVY) 為蛋白質(zhì)中全部殘基親水性總值與氨基酸數(shù)量之比. 而我們的預(yù)測(cè)結(jié)果得到SARS-CoV-2 N 蛋白AI 值為52.53, GRAVY 值為-0.971, 其閾值為[-2, 2],可見SARS-CoV-2 N 蛋白的GRAVY 值為負(fù)數(shù), 反之為正數(shù)就是疏水性, 說明SARS-CoV-2 N 蛋白具有強(qiáng)親水性. 疏水性結(jié)果圖如圖1 所示:

分析圖1 結(jié)果: 橫軸的Position 代表氨基酸殘基的位置, 縱軸的Score 代表疏水性分值.

3 利用深度學(xué)習(xí)的算法預(yù)測(cè)新型冠狀病毒核衣殼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

3.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用PSSM 提取SARS-CoV-2 N 蛋白序列特征.位點(diǎn)特異性打分矩陣(position-specific scoring matrix 即PSSM)是采用特殊位置重復(fù)基本局部對(duì)齊搜索工具即PSI-BLAST 在Swiss-Prot 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì), 將SARS-CoV-2 N 蛋白即目標(biāo)蛋白與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)鏈進(jìn)行多序列比較, 通過輸入命令: psiblast-query a.fasta-db./ db/ swissprot- num_ iterations3- out_ ascii-pssm 1.pssm. 即可將我們需要預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)生成20維的PSSM譜編碼.經(jīng)過PSI-BLAST 3次迭代完成后, 我們選取前20列所需要的打分矩陣, 由于生成的是整數(shù)矩陣, 進(jìn)一步選用Sigmoid 函數(shù)將PSSM 譜編碼中的整數(shù)重新調(diào)整即映射到[0,1]區(qū)間.Sigmoid 函數(shù)歸一化處理公式如下:

f[x]=1/1+exp(x).

滑動(dòng)窗口技術(shù)是在預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中用于對(duì)蛋白質(zhì)序列的采樣, 本實(shí)驗(yàn)基于滑動(dòng)窗口技術(shù)對(duì)中心蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)方式來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的8類二級(jí)結(jié)構(gòu),此操作的實(shí)現(xiàn)需要預(yù)先訓(xùn)練CNN, 選用窗口大小為17(窗口選擇應(yīng)為奇數(shù),且17的窗口大小也是我們實(shí)驗(yàn)的最佳選擇)的窗口, 從左向右依次取窗口大小的片段, 當(dāng)相鄰的殘基片段不足匹配我們選取的窗口大小時(shí)均采用零向量來填充. 以我們數(shù)據(jù)預(yù)處理的第1次滑動(dòng)就可以得到1個(gè)340(20×17) 維的氨基酸序列, 并用20×17 的一維向量對(duì)氨基酸進(jìn)行了表征.

3.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)介紹

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定了其功能. 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[6]是指多肽鏈主鏈原子借利用氫鍵沿一維方向排列產(chǎn)生的1種周期性結(jié)構(gòu)狀態(tài), 是多肽鏈局部的空間構(gòu)象. 一般來說, 包括β折疊,β轉(zhuǎn)角, 無規(guī)卷曲等形式. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行8類二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),8類二級(jí)結(jié)構(gòu)如表3 所示:

表3 8類蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

3.3 數(shù)據(jù)集選取

實(shí)驗(yàn)中使用了通用的基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集CB513. 該數(shù)據(jù)集包含513 個(gè)不重復(fù)的蛋白質(zhì)序列, 它們的相似度在1/4以下. 通過觀察數(shù)據(jù)集, 我們發(fā)現(xiàn)其中許多是NoSeq 結(jié)構(gòu), 指的是CB513 數(shù)據(jù)集中把每一個(gè)蛋白質(zhì)鏈都補(bǔ)成了700 的長度的氨基酸, 但是這種NoSeq 結(jié)構(gòu)對(duì)實(shí)際的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率會(huì)有很大的影響, 是毫無意義的. 所以實(shí)驗(yàn)將數(shù)據(jù)集中的NoSeq 結(jié)構(gòu)消去, PSSM 譜用來代替20 種氨基酸殘基. 由于CB513 數(shù)據(jù)集里有57 個(gè)通道, 我們調(diào)用函數(shù)目的是選用28 個(gè)特征用來訓(xùn)練我們的模型, 前20 個(gè)代表氨基酸殘基, 后8 個(gè)代表蛋白質(zhì)8類二級(jí)結(jié)構(gòu). 我們隨機(jī)打亂數(shù)據(jù)集后把數(shù)據(jù)集分成80% 的數(shù)據(jù)用來訓(xùn)練模型, 剩下的數(shù)據(jù)采用1∶1 的比例分別對(duì)模型進(jìn)行測(cè)試與驗(yàn)證. 而文中的目標(biāo)蛋白即SARS-CoV-2 N 蛋白序列可以從NCBI 上進(jìn)行fasta 文件下載, 這樣我們的SARS-CoV-2 N 蛋白數(shù)據(jù)可以重塑為1 種蛋白質(zhì)×419 個(gè)氨基酸殘基×28 種特征.

3.4 算法設(shè)計(jì)

文中設(shè)計(jì)的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是由輸入層, 隱含層包括3個(gè)一維卷積層和3個(gè)一維輸入的最大池化層, 與3個(gè)全連接層構(gòu)成. 卷積層使用卷積核對(duì)數(shù)據(jù)提取特征與特征映射, 而池化層會(huì)對(duì)經(jīng)過卷積層形成的特征圖進(jìn)行特征提取與信息過濾. 我們數(shù)據(jù)輸入類型是(蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)×氨基酸數(shù)目)×滑動(dòng)窗口數(shù)17×氨基酸殘基種類20. 在第1層卷積中設(shè)置了128 個(gè)卷積核, 卷積窗口的長度為5, 步長為1. 每經(jīng)過卷積后都設(shè)置了relu 激活函數(shù), 函數(shù)表現(xiàn)形式如下:

f(x)=max(0,x).

使用這種激活函數(shù)的好處是不會(huì)出現(xiàn)梯度消失的問題. 加入了批標(biāo)準(zhǔn)化(Batch Normalization, BN)層, 使得收斂速度和準(zhǔn)確率得以提升. 選取的最大池化層為2×2, 步長為2. 還建立了平坦(Flatten) 層, 由于經(jīng)過卷積核的卷積, 導(dǎo)致數(shù)據(jù)的維度發(fā)生了變化, 但是加入了平坦層后能將待處理的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成一維的向量, 對(duì)應(yīng)到輸入層的神經(jīng)單元上. 全連接層第1、2層均采用relu 激活函數(shù), 最后1層使用Softmax 函數(shù). Softmax 函數(shù)用在超過兩類的分類情況中, 它把輸出的整數(shù)值經(jīng)過函數(shù)公式重新調(diào)整到(0, 1)區(qū)間里, 有如下的函數(shù)表達(dá)式:

因此, 我們的算法模型圖走向流程如圖2 所示.圖中，Con-1, 2, 3表示一維卷積層1, 2, 3; dro-1, 2, 3代表dropout層, 它的作用是消除過擬合;den1-3表示第1, 2, 3全連接層.

圖2 算法模型圖

3.5 仿真結(jié)果與分析

3.5.1 仿真結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)過PSSM 譜編碼后的SARS-CoV-2 N 蛋白序列輸入CNN 模型后進(jìn)行預(yù)測(cè), 把數(shù)據(jù)輸入模型得出結(jié)果的流程圖如圖3 所示.

圖3 SARS-CoV-2 N蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)流程圖

圖4 是我們通過仿真得到的模型準(zhǔn)確率圖.

圖4 CNN準(zhǔn)確率

由圖4 可得, train表示訓(xùn)練集，validation表示驗(yàn)證集.本實(shí)驗(yàn)設(shè)置40次迭代次數(shù), 得到模型測(cè)試集的準(zhǔn)確度Q8 達(dá)到70%, Q8 代表蛋白質(zhì)8類二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度, Q8 的表達(dá)如下:

公式中的N表示氨基酸殘基總長度,Sii表示預(yù)測(cè)得到的第i類中確實(shí)第i類的氨基酸數(shù)目. 預(yù)測(cè)結(jié)果為從窗口采集的樣品中心殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu), 再把每列的數(shù)據(jù)加以匯總, 預(yù)測(cè)得到的結(jié)果如表4 所示:

表4 SARS-CoV-2 N蛋白8類二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

由結(jié)果表4 可以看出, SARS-CoV-2 N 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主.

3.5.2 仿真分析

本實(shí)驗(yàn)提出用深度學(xué)習(xí)算法來對(duì)SARS-CoV-2 N 蛋白的8類二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),并取得了與文獻(xiàn)[1]中秦小波等人使用ExPASy 服務(wù)器上的SOPMA、GOR 2個(gè)在線工具預(yù)測(cè)得到的結(jié)果一致, 說明SARS-CoV-2 N 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲占多.

文獻(xiàn)[2]中2種常用的在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)方法與我們的實(shí)驗(yàn)方法的對(duì)比結(jié)果如表5所示:

表5 SARS-CoV-2 N蛋白3種二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法對(duì)比結(jié)果

由對(duì)比結(jié)果表5表示，我們應(yīng)用的深度學(xué)習(xí)的方法比現(xiàn)有常用的兩項(xiàng)快速預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)方法的準(zhǔn)確度高，且我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示SARS-CoV-2 N蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲占主，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確有效.

用深度學(xué)習(xí)模型來對(duì)SARS-CoV-2 N 蛋白的8類二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè), 并成功取得了有效的結(jié)果. 但實(shí)驗(yàn)也存在不足之處, 其一, 就利用PSSM 提取特征的數(shù)據(jù)庫選取這一塊, 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫有很多, 文中選擇在Swiss-Prot 中進(jìn)行比對(duì), 但是此數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)數(shù)量偏少, 所以可以考慮使用更大的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行多重序列比對(duì)從而獲得更好的位點(diǎn)特異性打分矩陣; 其二, 可以參考蛋白質(zhì)的進(jìn)化信息對(duì)PSSM 進(jìn)行相應(yīng)添加, 比如可以添加疏水因子進(jìn)去, 得到的預(yù)測(cè)效果可能會(huì)更好.

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)分析SARS-CoV-2 核衣殼蛋白與SARS-CoV 核衣殼蛋白的序列相似性, 對(duì)SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的理化性質(zhì)和疏水性進(jìn)行分析; 在此基礎(chǔ)上提出基于位點(diǎn)特異性打分矩陣的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò), 預(yù)測(cè)SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的八類蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu). 研究結(jié)果表明, 核衣殼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)卷曲. 這為接下來使用深度學(xué)習(xí)模型對(duì)某種未知蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)提供了參考. 總而言之, 本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)使用深度學(xué)習(xí)模型對(duì)某種未知蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的實(shí)驗(yàn)提供了可能, 得知SARS-CoV-2 N 蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)信息, 從而為新型冠狀病毒肺炎的診斷以及疫苗的培育提供了參考.