婁水珠，朱婭寧，馬肖燕，李文義，杜剛，楊海英，汪偉光

(1.云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650500;2.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

植物內(nèi)生真菌是指存活于健康植物組織中，卻不會(huì)使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物[1]，它是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分.宿主植物與內(nèi)生真菌長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，互利共生[2]，使得內(nèi)生真菌往往可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富的次生代謝產(chǎn)物.研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌微生物天然產(chǎn)物代謝途徑的很多基因或基因簇都是沉默的.因此，激活這些沉默基因或基因簇將有可能產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物.如何激活植物內(nèi)生真菌中沉默的天然產(chǎn)物生物合成基因或基因簇成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[3].

利用化學(xué)表觀遺傳學(xué)方法來(lái)發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物是一種有效的策略，其機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等[4].其中，組蛋白去乙?；敢种颇軌蚴菇M蛋白去乙?；?、染色質(zhì)卷縮，抑制轉(zhuǎn)錄，沉默基因，抑制細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路、凋亡相關(guān)基因以及細(xì)胞黏附轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)，激活沉默基因[5]，代表修飾劑有伏立諾他、帕比司他、恩替諾特和西達(dá)本胺等.研究表明，通過(guò)化學(xué)表觀遺傳修飾，可以改變真菌次級(jí)代謝的分子機(jī)制，達(dá)到基因沉默或基因表達(dá)的目的[6-7].Cichewicz課題組于2008年最先提出運(yùn)用化學(xué)表觀遺傳修飾劑來(lái)抑制真菌中影響表觀遺傳的酶類激活一些沉默基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)真菌能產(chǎn)生未知的次級(jí)代謝產(chǎn)物，并且分離得到結(jié)構(gòu)新穎的骨架[8].2011年Asai對(duì)2株昆蟲(chóng)內(nèi)生真菌Torrubiellaluteorostrata和Cordycepsannullata進(jìn)行了化學(xué)表觀遺傳修飾劑作用下的研究，得到3個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的新化合物色氨酸異戊二烯類化合物[9].2013年Asai研究組在對(duì)1株由芍藥的葉片中分離得到的植物內(nèi)生真菌Graphiopaischlorocephala的研究中，在其培養(yǎng)基中添加煙酰胺進(jìn)行發(fā)酵，最終從發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了3個(gè)二苯甲酮類化合物[10]，該系列化合物均具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu).本課題組前期也從滇重樓內(nèi)生真菌分離得到Phomopsissp. 0391對(duì)其進(jìn)行組蛋白脫乙酰酶抑制劑誘導(dǎo)，得到新化合物13-angeloyloxy-diplosporin[11]以及雜色曲霉Aspergillusversicolor0312中的過(guò)表達(dá)產(chǎn)生新的化合物versicolor A.

本文對(duì)采自云南省呈貢區(qū)的野生重樓樣品中的1株菌寄生屬 (Hypomyces) 內(nèi)生真菌H. sp. CLG4 進(jìn)行了化學(xué)表觀遺傳學(xué)誘導(dǎo)發(fā)酵，對(duì)誘導(dǎo)后的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到6個(gè)化合物 (圖1)，化合物1～3、5和6為首次從滇重樓內(nèi)生真菌中分離得到.研究表明，該方法為激活藥用植物內(nèi)生真菌，獲取更多結(jié)構(gòu)多樣的天然產(chǎn)物提供了一定參考.

圖1 CLG4表觀遺傳學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜Aglient 1200 (美國(guó)Aglient公司);Avance III HD 600 (德國(guó)Bruker公司);Avance III HD 800 MHz (德國(guó)Bruker公司);Agilent，ZORBAX SB-C18柱 (250 mm×9.4 nm, 5 μm, Aglient公司)，LDZX-40B 立式自動(dòng)電熱蒸汽滅菌鍋 (上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SW-CJ-ZFD 型無(wú)菌操作臺(tái) (蘇凈集團(tuán)安泰公司);HP-900 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 (廣東省醫(yī)療器械廠);ZHWY-2102 恒溫培養(yǎng)振蕩器 (上海智城分析儀器制造有限公司);SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 (鞏義市英峪予華儀器廠);S20092819 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮).

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

柱層析法使用硅膠 (200～300目，青島海事)、恩替諾特 (湖北信康醫(yī)藥化工有限公司)、RP-18凝膠 (40～63 μm，YMC)、乙腈 (色譜純)、甲醇 (色譜純)、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、娃哈哈純凈水、二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮(均為工業(yè)級(jí))、DMSO為分析純.

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基 (PDA) (1L)：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 300 g，瓊脂 18 g，蒸餾水 1 000 mL, 121 ℃ 滅菌 20 min，冷卻備用.

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基 (PDB) (1L)：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 300 g，蒸餾水 1 000 mL, 121 ℃ 滅菌 20 min，冷卻備用.

恩替諾特終濃度為 500 μmoL/mL.

1.3 菌株的來(lái)源和鑒定

野生重樓采自云南省呈貢區(qū)梁王山的野生重樓，經(jīng)云南民族大學(xué)杜剛副教授鑒定為滇重樓(P.polyphyllavar.yunnanensis).經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，菌寄生屬內(nèi)生真菌 (H.sp. CLG4) 菌株從新鮮的重樓根部分離，且經(jīng)分子克隆手段鑒定，其ITS NCBI登錄號(hào)為：MT604986,菌株保存于云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.

1.4 菌株表觀遺傳篩選及發(fā)酵

將常溫條件下保藏的菌株取出，經(jīng)平板活化后備用.配制馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)(PDB)，按照 10∶1 的接種量進(jìn)行接種.于 30 ℃ 200 r/min 的條件下培養(yǎng) 3 d，將種子液分別接種2瓶 100 mL PDB培養(yǎng)基中，控制其他條件一致，空白組不加恩替諾特，實(shí)驗(yàn)組加入 100 μL 恩替諾特，培養(yǎng) 3 d.無(wú)菌條件下，取出 1 mL 菌液，乙酸乙酯萃取2次，每次 500 μL 乙酸乙酯，2次萃取的乙酸乙酯濃縮蒸干后用 100 μL 色譜甲醇溶解，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清 10 μL 進(jìn)行HPLC分析 (0～ 30 min，乙腈10%～100%梯度；流速 1 mL/min，進(jìn)樣體積 10 μL).發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生很多次生代謝產(chǎn)物，因此，以試驗(yàn)組同樣條件擴(kuò)大發(fā)酵 10 L.

1.5 CLG4次級(jí)代謝產(chǎn)物分離純化

發(fā)酵液 10 L，用多層紗布過(guò)濾，分離得到濾液和菌絲體.濾液用等體積的乙酸乙酯萃取6次，菌絲體用丙酮超聲提取，提取液濃縮至無(wú)丙酮后所得的水相再用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并兩部分的乙酸乙酯萃取物，在 40 ℃ 下減壓蒸餾得浸膏 15 g，經(jīng)硅膠柱 (200～300目) 層析，分別以純二氯甲烷、V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=(100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、1∶1)、純甲醇梯度洗脫，得到Fr.1～Fr.10，共10個(gè)組分.Fr.2以石油醚-乙酸乙酯溶劑體積比系統(tǒng)梯度洗脫，通過(guò)硅膠柱色譜反復(fù)純化得到化合物3(12.2 mg).Fr.3以二氯甲烷-甲醇溶劑體積比系統(tǒng)梯度洗脫，通過(guò)硅膠柱色譜，RP-18反向柱反復(fù)純化得到化合物1(109.0 mg)，6(114.4 mg)，4(19.5 mg)，F(xiàn)r.4以石油醚-乙酸乙酯溶劑體積比系統(tǒng)梯度洗脫，二氯甲烷-甲醇溶劑體積比系統(tǒng)梯度洗脫，通過(guò)硅膠柱色譜反復(fù)純化得到化合物5(28.3 mg)，2(10.1 mg).

2 結(jié)果與分析

2.1 表觀遺傳篩選結(jié)果

利用恩替諾特對(duì)菌株進(jìn)行表觀遺傳學(xué)篩選.對(duì)比空白組和實(shí)驗(yàn)組 (加入恩替諾特)，HPLC在 210 nm 處檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌株CLG4最敏感，如圖2所示.

圖2 CLG4代謝物HPLC分析圖

對(duì)比上述2組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出加入恩替諾特后，CLG4的代謝產(chǎn)物組成發(fā)生顯著變化，產(chǎn)生新的產(chǎn)物峰1～6.

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物2黃色固體，分子式C11H12O5,1H NMR(800 MHz,Acetone-d6)δ: 1.50 (3H,d,J=6.3Hz,3-CH3),2.87 (1H,m,H-4a),2.96 (1H,dd,J=16.2,3.2 Hz,H-4b),3.90 (3H,s,7-OCH3),4.72 (1H,m,H-3),6.53 (1H,s,H-5),11.05 (1H,s,8-OH).13C NMR (200 MHz,Acetone-d6)δ: 20.8 (CH3-3),34.6 (C-4),56.5 (OCH3-7),77.1 (C-3),103.0 (C-8a),103.2 (C-5),132 (C-7),133.7 (C-4a),151.1 (C-8),154.0 (C-6),170.9 (C-1).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，因此鑒定為6-demethylkigelin.

化合物5黃色固體，分子式C7H8O2,1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.58 (1H,d,J= 8.5 Hz,H-6),6.45 (1H,dd,J= 8.5,2.9 Hz,H-5),6.54 (1H,d,J= 2.9 Hz,H-3),2.12 (3H,s,CH3).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:149.3 (C-1),126.5(C-2),116.4 (C-3),150.9 (C-4),113.9(C-5),118.4(C-6),16.4(CH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，因此鑒定為pyrolin.

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)采用組蛋白去乙?；揎梽┒魈嬷Z特(Entinostat)對(duì)滇重樓內(nèi)生真菌CLG4(Hypomyces.sp)進(jìn)行化學(xué)表觀遺傳誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)與未誘導(dǎo)的滇重樓內(nèi)生真菌有顯著差別.對(duì)誘導(dǎo)后的菌株產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物分離純化，得到6個(gè)化合物，化合物1～3，5和6為首次從該內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中分離得到.化合物2為terrein，它是青霉和曲霉真菌的著名代謝物，具有廣譜的生物活性，如抗菌、抗腫瘤和酶抑制作用[13]；化合物3為(3R)-6-methoxymellein，它是一種常見(jiàn)的植物抗毒素，由胡蘿卜根產(chǎn)生，這種化合物具有廣泛的抗菌譜，能抑制幾種真菌的生長(zhǎng)，如酵母菌和細(xì)菌[14]；化合物4為(3R)-6,7-dimethoxymellein，它對(duì)人類病原真菌 (皮膚癬菌)、犬小孢子菌和長(zhǎng)毛癬菌具有顯著的抗真菌活性[14]；化合物6為6-demethylkigelin，它能抑制生長(zhǎng)[16].研究結(jié)果表明，化學(xué)表觀遺傳誘導(dǎo)方法，可使真菌的代謝產(chǎn)物類型發(fā)生顯著改變，推測(cè)這是表觀遺傳修飾劑誘導(dǎo)改變真菌代謝途徑的結(jié)果.表觀遺傳誘導(dǎo)為研究藥用內(nèi)生真菌在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物提供了一定借鑒.