陳云歡 吳旋 林幸清 汪欣

補陽還五湯，出自清代王清任《醫(yī)林改錯·卷下·癱痿論》，由生黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍七味中藥組成。本方重用黃芪，大補脾胃之元氣，使氣旺血行，祛瘀通絡，并配伍歸尾活血養(yǎng)血，使化瘀而不傷血；佐以川芎、赤芍、桃仁、紅花活血祛瘀，地龍通絡；諸藥合用，從而達到氣旺則血行，活血而又不傷正[1]。本方在臨床上廣泛用于治療腦缺血患者。腦缺血在中醫(yī)學上屬于中風病范疇，氣虛血瘀是本病的主要證型，治療多以益氣活血為主[2]。近年研究表明，補陽還五湯能夠從多靶點、多通路改善大腦缺血再灌注損傷，提高新生神經(jīng)元數(shù)量，促進神經(jīng)損傷修復[3-5]。為了探索補陽還五湯對腦缺血后神經(jīng)功能修復的作用靶點及防治機理，本實驗通過構建大鼠腦缺血-再灌注模型，分別采用不同劑量的補陽還五湯進行干預，通過分析自噬-溶酶體信號通路LAMP 蛋白表達變化探討補陽還五湯的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康清潔級雄性成年Wistar 大鼠50 只，體質(zhì)量約100 ～150g，購自福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心。隨機分成假手術組（145.99±0.81）g、模型組（146.77±0.97）g、補陽還五湯常規(guī)劑量組（146.46±1.13）g、補陽還五湯2 倍劑量組（146.35±1.03）g、補陽還五湯10 倍劑量組（147.01±1.12）g，每組10 只。

1.2 主要試劑和儀器

補陽還五湯（購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司），Western 一抗稀釋液、Western 二抗稀釋液、β-Actin 抗體、Western 轉膜液、Western 封閉液、SDS-PAGE 電泳液（碧云天生物科技公司），LAMP2 兔多克隆抗體、二抗HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體（美國PTG 公司），Western blot 電泳設備（Bio-rad 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠腦缺血模型構建 取清潔大鼠，術前禁食12 h，麻醉后，固定頭部及四肢，暴露頸部，切開皮膚鈍性分離至暴露頸動脈，采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型。

1.3.2 補陽還五湯灌胃 50 只大鼠隨機分成五組，每組10 只。假手術組：大鼠正常飼養(yǎng)，不進行任何干預；模型組：大鼠造模后不進行任何藥物干預；常規(guī)劑量組：2.5 g/（kg·只）；2 倍劑量組：5 g/（kg·只）；10 倍劑量組：25 g/（kg·只）。三組大鼠均每天灌胃1 次，造模前灌胃7 天，造模后繼續(xù)灌胃7 天。

1.3.3 LAMP2 蛋白表達水平 每組隨機取5 只大鼠斷頭取腦，取皮質(zhì)部分打勻漿，加入裂解液提取細胞總蛋白，置于4℃，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，轉移到PVDF 膜，室溫封閉2小時。加入一抗，4℃孵育過夜。加入相應二抗，室溫孵育2 小時，棄二抗稀釋液，洗滌。凝膠成像系統(tǒng)進行顯影和目標條帶的灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組間的比較采用t檢驗，兩組以上之間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LAMP2 表達

圖1 Western blot 結果顯示，與假手術組A 比較，組B 較細淺，組B 到組E 的條帶逐漸加深增粗，LAMP2 蛋白表達量呈現(xiàn)遞增的趨勢。尤其是10 倍劑量組E，兩條LAMP2 的蛋白條帶已經(jīng)接近假手術組A 了。假手術組LAMP2 蛋白表達水平明顯高于模型組、常規(guī)、2 倍及10 倍劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。模型組LAMP2 蛋白表達水平明顯低于假手術組、2 倍及10 倍劑量組（P＜0.01），與常規(guī)劑量組比較無統(tǒng)計學意義（P=0.230）。常規(guī)劑量組與假手術組，10 倍劑量組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與模型組（P=0.230）、2 倍劑量組（P=0.136）比較無統(tǒng)計學意義。10 倍劑量組與假手術組、模型組、常規(guī)劑量組比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與2 倍劑量組（P=0.071）比較無統(tǒng)計學意義。F=38.03，詳見表1。

圖1 LAMP2 蛋白表達（A：假手術組；B：模型組；C：常規(guī)劑量組；D：2 倍劑量組；E：10 倍劑量組）

表1 各組LAMP2 蛋白表達水平的比較（±s）

表1 各組LAMP2 蛋白表達水平的比較（±s）

注：與假手術組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.01；與常規(guī)劑量組比較，cP ＜0.01；與10 倍劑量組比較，dP ＜0.01

組別 例數(shù) LAMP2 假手術組 模型組 常規(guī)劑量組2 倍劑量組10 倍劑量組1.00±0.00bcd 0.53±0.09ad 0.60±0.08ad 0.67±0.05ab 0.75±0.07abc 5 5 5 5 5

3 討論

腦缺血是一種死亡率和致殘率都較高的多因素疾病，尤其是對老年人的傷害比較嚴重。腦缺血發(fā)病率高，預后差，帶來的傷殘甚至死亡會給患者自身、家庭、社會都帶來沉重的負擔。在現(xiàn)代的中西醫(yī)治療中，均以疏通腦血栓、活血化瘀為原則。中藥方劑補陽還五湯是治療缺血中風的有效方劑，具有補氣、活血、通絡之效，主要治療由缺血性腦病、中風后遺癥等引起的半身不遂，肢體麻木，口眼歪斜等癥狀[6-7]。

研究表明，局灶性腦缺血損傷能活化自噬/溶酶體途徑，可致皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)的自噬體增多進而引起該區(qū)域溶酶體活性的增加[8-9]。自噬溶酶體系統(tǒng)能對自身胞質(zhì)內(nèi)的異物、損傷和衰老細胞器進行吞噬降解，以使細胞內(nèi)的各種能量物質(zhì)循環(huán)再利用進而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保證細胞正常生長和器官正常發(fā)育。自噬分為大自噬、小自噬、CMA，LAMP-2 蛋白是參與CMA 的關鍵分子。LAMP-2 是溶酶體膜上的單次跨膜蛋白，是一種重度糖基化1 型膜蛋白，與分子伴侶性自噬直接相關[10]。當細胞受到氧化性損傷時，細胞內(nèi)蛋白暴露出KFERQ 序列，被作為分子伴侶的Hsc70 識別，形成分子伴侶-底物復合物，該復合物與溶酶體膜上的LAMP-2a結合，隨后溶酶體內(nèi)的Lys-Hsc70 運送損傷蛋白質(zhì)進入溶酶體內(nèi)降解的過程，此過程為CMA。LAMP2a 在溶酶體膜上的表達水平直接決定了CMA 活性[11-12]。本實驗研究結果表明，假手術組的LAMP2 的蛋白表達量明顯高于其余各組（P ＜0.01），模型組的LAMP2 的蛋白表達低于假手術組、2 倍及10 倍劑量組（P ＜0.01），與常規(guī)劑量組的比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。從結果看，常規(guī)劑量治療基本無效；2 倍劑量效果尚不明確，具體確定療效可能需要進一步增加樣本數(shù)；10 倍劑量治療效果肯定，但依舊低于假手術組，說明治療效果無法完全恢復正常。從實驗結果推測，補陽還五湯可能通過上調(diào)LAMP2 蛋白的表達使CMA 活性上調(diào)，CMA 活性上調(diào)在腦缺血時可選擇性地清除某些錯誤編輯的蛋白或受損的細胞器，維持神經(jīng)細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞，幫助神經(jīng)功能恢復，進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

本研究探討了補陽還五湯通過上調(diào)LAMP2 蛋白去激活可能存在的CMA 自噬途徑，揭示了補陽還五湯對腦缺血發(fā)揮神經(jīng)保護作用的潛在新機制，但如何上調(diào)，如何激活的確切機制尚需進一步研究。如進一步通過電鏡觀察受損神經(jīng)元是否有增加的自噬體出現(xiàn)，補陽還五湯治療后自噬體數(shù)量和超微結構的變化過程；保護腦缺血的自噬途徑信號通路中上、下游分子的作用等都還有待深入闡明，從而為預防和治療缺血性腦血管疾病提供更有效的作用靶點，為中醫(yī)藥防治疾病提供細胞層面的微觀依據(jù)。