周正 李卿 陳萬(wàn)生 張磊

（1. 海軍特色醫(yī)學(xué)中心，上海 200433；2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003；3. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433）

天然產(chǎn)物根據(jù)其生源途徑，分為初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物大多由生物大分子（多糖、核酸、脂類和蛋白質(zhì)）的合成和降解形成，對(duì)維持植物基本的生命活動(dòng)具有不可替代的作用，貫穿生命的全程；次生代謝產(chǎn)物則是生物體特有的代謝途徑中所產(chǎn)生的各種特殊分子類型，其骨架往往比初生代謝產(chǎn)物更為復(fù)雜，往往發(fā)生在生命過(guò)程的某一階段。

控制天然產(chǎn)物生物合成的基因決定了不同種類天然產(chǎn)物的產(chǎn)生與累積，即基因的多樣性導(dǎo)致天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性。目前，藥用植物天然產(chǎn)物的研究中最前沿的科學(xué)問(wèn)題是：各種復(fù)雜的天然產(chǎn)物是如何形成的？能否通過(guò)調(diào)控，大量獲得提取困難、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、應(yīng)用需求廣泛的天然產(chǎn)物。為了解決這些問(wèn)題，需要解析天然產(chǎn)物生物合成途徑中關(guān)鍵酶的功能，了解這些基因的表達(dá)和調(diào)控，進(jìn)而對(duì)整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，甚至將不同來(lái)源的生物合成相關(guān)的代謝途徑模塊化，在底盤細(xì)胞上進(jìn)行組裝，利用合成生物學(xué)的手段，實(shí)現(xiàn)各種重要的藥用植物天然產(chǎn)物的高效生物合成和規(guī)?；a(chǎn)。而所有問(wèn)題的本源便是生物合成途徑和關(guān)鍵催化酶的解析。

本文針對(duì)藥用植物天然產(chǎn)物生物合成及關(guān)鍵催化酶的研究策略進(jìn)行系統(tǒng)綜述，從藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑的推測(cè)、天然產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵催化酶的發(fā)現(xiàn)與預(yù)測(cè)、酶的表達(dá)特征研究、體內(nèi)酶功能研究、酶催化特征研究、酶結(jié)構(gòu)解析與優(yōu)化、合成生物學(xué)研究這6個(gè)方面進(jìn)行總結(jié)和討論。

1 生物合成途徑的推測(cè)

通過(guò)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，推測(cè)目標(biāo)化合物的生物合成途徑，是目標(biāo)天然產(chǎn)物生物合成途徑催化酶研究的基礎(chǔ)。20世紀(jì)下半葉，隨著初生代謝途徑的解析基本完成，萜類、生物堿、苯丙素類等天然產(chǎn)物的組裝化學(xué)原理開始呈現(xiàn)。根據(jù)基本的化學(xué)反應(yīng)原理，結(jié)合研究物種中所分離到的天然產(chǎn)物，首先提出目標(biāo)化合物的生物合成途徑假說(shuō)。接下來(lái)則通過(guò)同位素示蹤實(shí)驗(yàn)，即通過(guò)穩(wěn)定重原子標(biāo)記初生代謝產(chǎn)物作為底物進(jìn)行飼喂，再利用核磁共振或者高分辨質(zhì)譜，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)并追蹤含有同位素原子代謝物的流向，進(jìn)而驗(yàn)證所提出的天然產(chǎn)物生物合成途徑假說(shuō)的正確性。

同位素示蹤法廣泛應(yīng)用于解析藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑的研究中。如在紫杉醇生物合成途徑的推測(cè)中，Eisenreich等［1］對(duì)紅豆杉（Taxus chinensis）的懸浮細(xì)胞飼喂前體［U-13C6］葡萄糖、［1-13C6］葡萄糖、［1，2-13C12］醋酸，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物 ［1，2-13C12］醋酸僅轉(zhuǎn)化到taxuyunnanine C的4個(gè)乙?；鶄?cè)鏈，卻未轉(zhuǎn)移到紫杉烷的環(huán)形骨架上；而兩個(gè)被標(biāo)記的葡萄糖不僅轉(zhuǎn)移到了taxuyunnanine C的乙?；校瑫r(shí)也轉(zhuǎn)移到了紫杉烷的環(huán)形骨架。以上結(jié)果表明，紫杉烷的環(huán)形骨架來(lái)源于DXP/MEP途 徑（deoxyxylulose phosphate or methylerythritol phosphate pathway）。在莨菪堿的生物合成途徑推測(cè)中，Robins等［2］以3-苯基-［2-13C，2-2H］乳酸、苯基- ［1，3-13C2］乳酸以及［1'，3'-13C，甲基-2H3］海螺堿飼喂曼陀羅毛狀根（Datura innoxia），通過(guò)2D-NMR檢測(cè)13C、1H、2H，發(fā)現(xiàn)托品和來(lái)自苯丙氨酸的苯乳酸通過(guò)縮合反應(yīng)生成海螺堿。在丹酚酸途徑生物合成途徑推測(cè)中，Di等［3］用13C標(biāo)記的苯丙氨酸飼喂丹參（Salvia miltiorrhiza）毛狀根，通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)丹酚酸成分的天然產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)丹參中迷迭香酸的產(chǎn)生途徑可能與已報(bào)道的彩葉草途徑有差異，同時(shí)預(yù)測(cè)迷迭香酸可能是丹酚酸B的前體化合物；而在丹參酮生物合成途徑的研究中，Guo等［4］利用13C標(biāo)記的次丹參酮二烯飼喂丹參毛狀根，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了隱丹參酮和鐵銹醇的生成，證明了兩種物質(zhì)是丹參酮合成的中間產(chǎn)物。

大量的研究表明，同樣類型的化合物大多共用一套生物合成途徑，骨架合成酶和后修飾酶的種類，在特定結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物的形成中基本一致［5-8］。因此，在后基因組時(shí)代，如苯丙素類、萜類、生物堿、黃酮等主要類型的藥用植物天然產(chǎn)物的生物合成途徑已逐步完善，基于同位素飼喂推斷代謝產(chǎn)物生物合成途徑的方法不像之前使用那樣頻繁。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，大量生信工具通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)的分析及計(jì)算，便可以提供化學(xué)原理和酶學(xué)機(jī)制的高通量信息，幫助解析目標(biāo)化合物的生物合成途徑。但是，對(duì)于一些基因組數(shù)據(jù)龐大、轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)研究較為復(fù)雜的物種，同位素標(biāo)記仍然發(fā)揮著極其重要的作用，比如在2016年Anttila等［9］利用同位素標(biāo)記法標(biāo)記［13C-甲基］蛋氨酸研究海洋甲藻（Alexandrium ostenfeldii）中聚酮類螺亞胺的生物合成途徑。

2 關(guān)鍵催化酶的挖掘和篩選

目標(biāo)天然產(chǎn)物的生物合成途徑明確之后，則需要對(duì)目標(biāo)關(guān)鍵催化酶進(jìn)行挖掘和篩選。早期科研工作者僅是通過(guò)蛋白質(zhì)分離對(duì)酶的活性進(jìn)行驗(yàn)證，但是受制于檢測(cè)手段和測(cè)序技術(shù)，酶的挖掘和鑒定過(guò)程非常緩慢。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)于關(guān)鍵酶的發(fā)現(xiàn)不再局限于傳統(tǒng)的分離純化和鑒定，而是基于各種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，通過(guò)酶的氨基酸序列與酶結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行挖掘。相比于已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證功能的酶，絕大多數(shù)酶的功能仍然是未知的。根據(jù)未知酶和已知酶之間的相似性，對(duì)未知酶的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，已經(jīng)成為酶學(xué)研究中非常普遍的研究手段。盡管序列相似性預(yù)測(cè)不能完全找到整個(gè)酶家族中所有進(jìn)化和功能的聯(lián)系，但是對(duì)于催化酶的挖掘來(lái)說(shuō)具有十分重要的意義。此外，為了縮小候選基因的范圍，常常通過(guò)多種組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合的分析方法，如轉(zhuǎn)錄組學(xué)與基因組學(xué)、代謝組學(xué)相結(jié)合的方法，并輔助以酶的表達(dá)特征分析，如亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)、GUS實(shí)驗(yàn)、組織器官表達(dá)水平分析等，對(duì)生物合成途徑的關(guān)鍵催化酶進(jìn)行篩選。

2.1 傳統(tǒng)酶的分離純化方法

酶的提取、分離、純化是指把酶從組織或者細(xì)胞內(nèi)外提取出并使之達(dá)到相應(yīng)程度的過(guò)程，一般包括5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、酶液提取、酶分離純化、酶濃縮、酶檢測(cè)與保存。其中最重要的的步驟便是分離純化，目前常用的分離純化方法包括離心分離、過(guò)濾分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離和結(jié)晶分離等。以嗎啡生物合成途徑解析為例，從1967年提出嗎啡的生物合成途徑假說(shuō)以來(lái)，數(shù)十年來(lái)科學(xué)家們通過(guò)蛋白分離純化鑒定出了數(shù)種關(guān)鍵催化酶。如Roswitha于1993年利用7步程序，從罌粟（Papaver somniferum）的細(xì)胞懸浮液中分離純化得到了可以將罌粟生物堿salutaridine還原成（7S）-salutaridinol的氧化NADPH-7-氧化還原酶［10］。1995年，Rainer又從罌粟細(xì)胞懸液中分離得到了Salutaridinol-7-O-?；D(zhuǎn)移酶，解析了嗎啡前體蒂巴因生成過(guò)程［11］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和組學(xué)數(shù)據(jù)的應(yīng)用，僅十幾年的時(shí)間，嗎啡的生物合成途徑便已經(jīng)基本闡明，甚至成功在酵母中進(jìn)行了前體的異源合成［12］，這將在后文詳細(xì)說(shuō)明。

2.2 基于共表達(dá)分析挖掘關(guān)鍵催化酶

共表達(dá)分析（Co-expression analysis）是通過(guò)大量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建基因之間的相關(guān)性，從而篩選、挖掘基因功能的一類分析方法。研究表明，在植物體內(nèi)同一個(gè)代謝通路上的基因，在受到體外或體內(nèi)刺激后，這些基因在表達(dá)量變化上會(huì)出現(xiàn)共表達(dá)的趨勢(shì)。通過(guò)這一特性，對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后所獲得的龐大數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、注釋和可視化，對(duì)目標(biāo)催化關(guān)鍵酶進(jìn)行挖掘。

Di等［3］利用茉莉酸甲酯和脫落酸誘導(dǎo)丹參的毛狀根，根據(jù)酚酸基因表達(dá)水平的變化，尋找到了丹參迷迭香酸合成酶（SmRAS）、細(xì)胞色素P450單加氧酶（SmCYP98A14）和細(xì)胞色素P450還原酶（SmCPR）。Li等［13］利用茉莉酸甲酯處理菘藍(lán)毛狀根，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，首次從菘藍(lán)（Isatis indigotica）發(fā)現(xiàn)了Dirigent蛋白家族19個(gè)基因，并對(duì)其進(jìn)行了序列特征和表達(dá)分析，這為該類蛋白的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

此外，通過(guò)共表達(dá)分析結(jié)合代謝數(shù)據(jù)的方法，Xiao等同樣使用茉莉酸甲酯處理菘藍(lán)毛狀根，研究落葉松脂素生物合成途徑的基因表達(dá)水平，并結(jié)合木脂素成分的積累水平，繪制了“基因與化合物”關(guān)聯(lián)性熱圖，篩選出27個(gè)與菘藍(lán)木脂素合成相關(guān)的基因，并對(duì)菘藍(lán)松脂醇還原酶IiPLR1基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在落葉松脂素的積累中發(fā)揮重要的作用［14-15］。Wang等［16］對(duì)不同紫草素積累量的新疆紫草（Arnebia euchroma）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合新疆紫草不同器官中的基因表達(dá)水平、關(guān)鍵酶的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)，鑒定出了催化香葉基氫醌轉(zhuǎn)變?yōu)樽喜菟厍绑w的關(guān)鍵羥化酶CYP76B74。

2.3 基于基因組挖掘關(guān)鍵催化酶

相比于基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過(guò)基因的表達(dá)量挖掘關(guān)鍵催化酶，高質(zhì)量的基因組數(shù)據(jù)提供了更為全面準(zhǔn)確的信息，其可以在群體水平上揭示個(gè)體之間基因的變化差異，從分子水平理解基因的結(jié)構(gòu)、組成、功能和進(jìn)化。

Zhao等［17］通 過(guò) 黃 芩（Scutellaria baicalensis）基因組測(cè)序，揭示了漢黃芩素完整的生物合成途徑。根據(jù)基因組，共注釋了28 930個(gè)基因，并在黃芩特有的串聯(lián)重復(fù)區(qū)內(nèi)找到6個(gè)氧甲基轉(zhuǎn)移酶（SbPFOMT）候選基因。通過(guò)組織器官表達(dá)分析以及茉莉酸誘導(dǎo)黃芩毛狀根實(shí)驗(yàn)，對(duì)篩選到的PFOMT進(jìn)行進(jìn)一步篩選。最終結(jié)合體外酶催化和體內(nèi)RNA抑制實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了PFOMT5是催化漢黃芩素生成的關(guān)鍵酶。Ma等［18］對(duì)自交6代純合的丹參株系進(jìn)行基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，形成丹參酮前體母核的二萜合酶與細(xì)胞色素P450基因以基因簇的方式存在于鼠尾草屬植物中。利用基因擴(kuò)張和收縮分析，聚焦于丹參中明顯擴(kuò)張的SmCYP71D亞家族，并篩選到了4個(gè)候選基因。后續(xù)研究表明，SmCYP71D373和SmCYP71D375可以催化丹參酮特征五元呋喃環(huán)的生成，SmCYP71D411與丹參酮類化合物C20位脫甲基化過(guò)程相關(guān)。Guo等［19］利用多種測(cè)序技術(shù)組裝獲得了罌粟的基因組，發(fā)現(xiàn)罌粟中那可丁和嗎啡類生物堿合成途徑中15個(gè)基因在11號(hào)染色體上形成超級(jí)基因簇（BIA基因簇），從而高效合成罌粟中的各種次生代謝產(chǎn)物，同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)BIA通路基因在根和莖中特異性表達(dá)且共表達(dá)。此外，根據(jù)序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)P450和氧化還原酶基因融合形成了一個(gè)STORR基因，該基因?qū)τ诶浰谥袉岱鹊纳锖铣删哂嘘P(guān)鍵作用。該研究揭示了罌粟基因組的復(fù)制、重排及基因融合導(dǎo)致了罌粟有效成分合成途徑的進(jìn)化。

目前，越來(lái)越多的研究結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組，對(duì)藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑中的關(guān)鍵催化酶進(jìn)行挖掘。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組挖掘差異基因，快速圈定核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵候選基因；通過(guò)代謝組尋找目標(biāo)化合物的差異累積，將候選基因與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)；通過(guò)基因組對(duì)候選基因進(jìn)行定位，結(jié)合序列的多態(tài)性全面對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行描述；通過(guò)酶表征數(shù)據(jù)，對(duì)酶基因的性質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)。通過(guò)多組學(xué)聯(lián)合的方法，達(dá)到高效、快速挖掘、鑒定天然產(chǎn)物生物合成途徑催化酶基因的目的。

3 酶催化特征研究

在挖掘到一系列參與天然產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵候選酶基因后，接下來(lái)需要對(duì)酶的功能進(jìn)行研究。首先對(duì)目標(biāo)酶分離、純化或通過(guò)分子生物學(xué)的手段進(jìn)行異源表達(dá)、純化；然后對(duì)酶的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；接下來(lái)對(duì)酶進(jìn)行功能表征，檢測(cè)是否在適當(dāng)?shù)臈l件下催化底物生成相應(yīng)的產(chǎn)物；最后開展酶催化的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究，多角度描述酶的催化特征。

3.1 酶的異源表達(dá)

在藥用植物關(guān)鍵酶的研究中，常見的異源表達(dá)宿主有大腸桿菌、酵母和煙草，其它不太常用的表達(dá)系統(tǒng)還包括一些真菌、昆蟲及哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

大腸桿菌作為原核生物，具有繁殖速度快、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)成本較低和遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，常常作為酶蛋白異源表達(dá)的首選宿主。但是原核表達(dá)系統(tǒng)也存在一些局限，如分泌表達(dá)能力弱、二硫鍵形成困難導(dǎo)致蛋白折疊錯(cuò)誤、無(wú)翻譯后修飾等缺點(diǎn)，限制了其在復(fù)雜酶的表達(dá)中的應(yīng)用。而真核生物表達(dá)系統(tǒng)則主要是以酵母為主體，常用酵母宿主有釀酒酵母和畢赤酵母。相比于原核表達(dá)宿主，酵母系統(tǒng)具有外源基因整合穩(wěn)定、易于調(diào)控表達(dá)、重組蛋白以胞內(nèi)積累或胞外分泌的形式表達(dá)、存在翻譯后修飾、發(fā)酵密度極高等優(yōu)勢(shì)。煙草作為近些年來(lái)興起的植物表達(dá)宿主，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)體系，使外源基因無(wú)需整合在煙草基因組中就可以進(jìn)行表達(dá)，不受基因位置效應(yīng)以及沉默的影響。基于煙草的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，即可以作為酶體外功能快速驗(yàn)證的平臺(tái)，又可以作為酶體內(nèi)功能研究的輔助，具有快速、高效的特點(diǎn)。

Fu等［20］利用大腸桿菌為宿主，表達(dá)出了紫錐菊（Echinacea purpurea）中菊苣酸合成的BAHD家族酰基轉(zhuǎn)移酶，EpHTT、EpHQT和EpHCT；同時(shí)利用釀酒酵母表達(dá)出SCPL家族?；D(zhuǎn)移酶，EpCAS。根據(jù)體外酶促反應(yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EpHTT催化咖啡酰輔酶A和酒石酸反應(yīng)生成咖啡酰酒石酸，EpHQT催化咖啡酰輔酶A及奎寧酸反應(yīng)生成綠原酸，兩個(gè)產(chǎn)物再進(jìn)一步被EpCAS催化，生成菊苣酸和奎寧酸，該研究完整解析了紫錐菊中菊苣酸的生物合成途徑，并對(duì)關(guān)鍵催化酶進(jìn)行了確認(rèn)。Tu等［21］通過(guò)釀酒酵母表達(dá)出雷公藤（Tripterygium wilfordii）中P450單加氧酶，TwCYP728B70并發(fā)現(xiàn)該單加氧酶可以催化三步氧化反應(yīng)生成雷公藤甲素中間體脫氫樅酸，為雷公藤甲素生物合成途徑的解析奠定了基礎(chǔ)。Fei等［22］通過(guò)底物拓品和苯乳酸共注射的方式，在煙草中瞬時(shí)表達(dá)從顛茄（Atropa belladonna）中篩選到的苯乳酸UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶AbUGT1和海螺堿合成酶AbLS，確認(rèn)了AbUGT1和AbLS的功能，AbUGT1催化苯乳酸和UDP-葡萄糖生成苯乳酰葡萄糖，進(jìn)一步和托品在AbLS的催化下酯化縮合生成海螺堿。

3.2 酶理化性質(zhì)研究

由于絕大部分的酶是蛋白質(zhì)，所以酶理化性質(zhì)研究本質(zhì)是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)研究。根據(jù)化學(xué)組成的差異分為單純蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)，結(jié)合蛋白質(zhì)中的非蛋白部分稱為酶的輔助因子，包括有機(jī)化合物（糖類、脂質(zhì)等）和金屬離子。

酶理化性質(zhì)研究主要研究包括分子量、等電點(diǎn)以及輔助因子的確定。酶的分子量一般通過(guò)其氨基酸序列便可預(yù)測(cè)，通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行驗(yàn)證，分子量大小的單位以道爾頓（Da）表示。等電點(diǎn)的含義是，使蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等的兼性離子時(shí)，酶溶液的pH。該數(shù)值同樣可以根據(jù)氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)等電聚焦電泳技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。輔助因子可通過(guò)化學(xué)顯色法、酶處理學(xué)或借助質(zhì)譜、核磁等儀器檢測(cè)來(lái)確定。

Ma等［23］從鹽膚木（Rhus chinensis）中篩選到了苯丙氨酸解氨酶基因，通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá)，獲得了PcPAL重組蛋白。通過(guò)SDS-PAGE電泳，驗(yàn)證了表達(dá)出蛋白的大小約為77 kDa。接下來(lái)對(duì)PcPAL的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應(yīng)溫度為45℃、最適反應(yīng)pH為9.0，本研究首次從漆樹科植物中克隆了PAL基因并對(duì)該酶的基本理化性質(zhì)進(jìn)行了探究。Su等［24］從羅漢果（Siraitia grosvenorii）中克隆出了由417個(gè)氨基酸構(gòu)成的鯊烯合酶SgSQS，其可以催化法尼基焦磷酸生成鯊烯。通過(guò)大腸桿菌為宿主表達(dá)出SgSQS，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白大小為47 kD，等電點(diǎn)為7.3。隨后又對(duì)該酶的最適反應(yīng)溫度和pH進(jìn)行研究，結(jié)構(gòu)表明在37℃ 以及 pH 7.5的條件下，鯊烯合酶的活性最高。

3.3 酶對(duì)底物選擇性研究

酶對(duì)底物的選擇性研究是判斷酶專一性或雜泛性的重要依據(jù)。當(dāng)酶只催化一種物質(zhì)或某一類特定物質(zhì)發(fā)生一定反應(yīng)時(shí)顯示出專一性。反之酶催化雜泛性則表現(xiàn)為具有底物的寬泛性與反應(yīng)的多樣性。

Wang等［25］在傳統(tǒng)中藥黃芩中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)黃酮3號(hào)位氧糖基化酶Sb3GT1（UGT78B4）。該酶可以接受5種不同的糖供體，包括：二磷酸尿苷葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖、木糖、阿拉伯糖。同時(shí)Sb3GT1也可以催化17種黃酮醇類化合物，轉(zhuǎn)換率達(dá)到98%以上，并催化形成5個(gè)全新的黃酮苷類化合物，表明該酶具有較強(qiáng)的雜泛性。Gao等［26］從桑樹（Morusalba）愈傷組織中鑒定出兩個(gè)FAD依賴的單加氧酶MaMO以及MaDA。MaDA能高效、選擇性地催化分子間［4+2］環(huán)加成反應(yīng)（Diels-Alder反應(yīng)）生成環(huán)己烯結(jié)構(gòu)單元，且對(duì)二烯體及親二烯體具有較寬的底物雜泛性；MaMO則可以催化異戊烯基氧化形成二烯體，兩者共同完成桑中活性成分chalcomoracin的生物合成。

3.4 酶催化的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究

酶催化的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究通常在酶催化反應(yīng)的最適條件下進(jìn)行。通過(guò)考察不同pH、溫度和金屬離子濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響確定最適反應(yīng)條件。

Wu等［27］從馬尿泡（Przewalskia tangutica）中分離純化了兩個(gè)托品酮還原酶基因PtTRI 和 PtTRII，并于最適pH測(cè)定了兩個(gè)托品酮還原酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，根據(jù)Kcat、Km、Kcat/Km的比較，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于PtTRI，托品酮是PtTRII的最適底物，且根據(jù)其它物種托品酮還原酶的報(bào)道，PtTRI對(duì)托品酮表現(xiàn)出更高的親和力。Yu等［28］通過(guò)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)紅景天（Rhodiola sachalinensis）細(xì)胞培養(yǎng)體系，挖掘了紅景天苷生物合成途徑中的兩個(gè)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶RsUGT72B14 和RsUGT74R1。根據(jù)Kcat/Km比較兩個(gè)酶對(duì)于底物對(duì)羥苯基乙醇催化效率，發(fā)現(xiàn)RsUGT72B14的催化效率是RsUGT74R1的6倍。結(jié)合不同器官中兩個(gè)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量，明確了RsUGT72B14在紅景天苷的生成發(fā)揮重要的作用。Xiang等［29］從川西獐牙菜（Swertia mussotii）中篩選并鑒定了兩個(gè)環(huán)烯醚萜合成酶SmIS1和SmIS2，其中SmIS1的大小約為88 kD，SmIS2的大小約為46 kD。以8-oxogeranial為底物，NADPH為輔因子，測(cè)定SmIS1和SmIS2的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明，相比于SmIS1，SmIS2對(duì)底物有著較低的親和力，卻對(duì)NADPH有著較高的親和力。并且與長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）和油橄欖（Olea europaea）中的環(huán)烯醚萜合成酶相比，SmIS1的催化效率降低。

4 體內(nèi)酶功能研究

通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)明確了天然產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵酶的催化功能后，需要對(duì)目標(biāo)基因在生物體內(nèi)的功能進(jìn)行研究。常用的酶體內(nèi)功能研究策略是通過(guò)基因的敲除或抑制，使目標(biāo)酶基因在體內(nèi)的表達(dá)量降低，以及通過(guò)基因的過(guò)表達(dá)操作增加目標(biāo)酶基因在體內(nèi)的表達(dá)量。通過(guò)酶表達(dá)量的變化，結(jié)合轉(zhuǎn)錄、代謝、表型等方面的數(shù)據(jù)，研究酶在藥用植物體內(nèi)的功能。但是，由于遺傳轉(zhuǎn)化體系的限制，部分無(wú)法獲得目標(biāo)酶基因穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因物種，則可以通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)或者將基因在其它相近物種中進(jìn)行表達(dá)，根據(jù)表型的變化，驗(yàn)證酶的體內(nèi)功能。

4.1 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的酶基因敲除研究

CRISPR/Cas9技術(shù)是指在gRNA的引導(dǎo)下靶向基因組特定區(qū)域，并指導(dǎo)Cas9蛋白切割基因雙鏈，形成移碼突變或片段敲除的方法，該技術(shù)可以使基因永久性的表達(dá)沉默。

Zhou等［30］利 用CRISPR/Cas9技 術(shù) 敲 除 了丹參中酚酸生物合成的關(guān)鍵酶—迷迭香酸合成酶SmRAS，發(fā)現(xiàn)迷迭香酸和丹酚酸的含量顯著降低，證明了SmRAS在丹酚酸途徑中的發(fā)揮重要的作用；而Li等［31］則利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了丹參酮生物合成途徑中丹參二萜合酶—SmCPS1，發(fā)現(xiàn)在純合敲除株系丹參酮IIA、隱丹參酮的積累幾乎消失，證明了SmCPS1在丹參酮生源途徑中的作用。通過(guò)基因編輯技術(shù)，Dinkins等［32］敲除紅車軸草（Trifolium pratense）中的異黃酮合酶TpIFS1，獲得了單鏈突變的雜合突變植株，后利用雜交獲得TpIFS1敲除的純合突變株系。對(duì)突變的純合株系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其異黃酮芒柄花黃素、鷹嘴豆素A還有金雀異黃酮的積累顯著下降。對(duì)黃酮生物合成途徑基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TpIFS1敲除后，其上游基因泵丙氨酸裂解酶、查爾酮合酶的表達(dá)量顯著提高，而下游基因的表達(dá)量沒有顯著變化。

4.2 基于基因沉默技術(shù)的酶基因抑制研究

基因沉默的方法主要有RNA干擾（RNA inference，RNAi）和病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus Induced Gene Silencing，VIGS）兩種方法。RNAi指利用同源性的RNA雙鏈（dsRNA）誘導(dǎo)與之互補(bǔ)的同源目標(biāo)序列mRNA降解，阻斷體內(nèi)靶基因的表達(dá)，使植物出現(xiàn)目標(biāo)基因缺失的表型，該技術(shù)一般用于轉(zhuǎn)基因體系成熟的物種研究。VIGS是指攜帶目標(biāo)基因片段的病毒侵染植物后，可誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默、引起表型變化，該方法一般用于未建立轉(zhuǎn)基因體系的物種研究。

Zhao等［33］利用RNAi技術(shù)抑制人參（Panax ginseng）中β-香樹酯醇合成酶，獲得了轉(zhuǎn)基因毛狀根，發(fā)現(xiàn)β-AS的表達(dá)量降低后，β-香樹脂醇以及齊墩果烷型的人參皂甙R0的含量顯著降低，而總?cè)藚⒃碥疹惢衔锏暮棵黠@提高，表明β-AS在人參皂苷的合成中具有重要的催化作用。同樣是在人參中，Lu等［34］也從人參和西洋參（Panax quinquefolius）中鑒定到了兩個(gè)高度同源的糖基轉(zhuǎn)移酶，Pq3-O-UGT2 and PgUGT94Q2，兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶分別可以將UDP葡萄糖上的葡萄糖部分轉(zhuǎn)移到人參皂苷Rh2和F2來(lái)產(chǎn)生人參皂苷Rg3和Rd。通過(guò)轉(zhuǎn)基因毛狀根轉(zhuǎn)化體系，獲得人參和西洋參中兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶抑制的RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根，分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因分別抑制后，人參皂苷Rd、原人參二醇和總?cè)藚⒍嫉姆e累均出現(xiàn)了下降，此外原人參二醇合酶和元人參三醇合酶的表達(dá)量也顯著提高，表明兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶分別在人參和西洋參人參皂苷的合成中具有關(guān)鍵調(diào)控作用。Sarma等［35］利用VIGS技術(shù)沉默長(zhǎng)春花中牻牛兒基焦磷酸合酶CrGGPP，研究其功能，發(fā)現(xiàn)CrGGPP的表達(dá)量降低后，單萜吲哚生物堿類相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以及合成途徑相關(guān)的基因表達(dá)量明顯降低，同時(shí)單萜吲哚生物堿類的含量也隨之下降。而通過(guò)對(duì)CrGGPP-VIGS葉片進(jìn)行化學(xué)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)可以恢復(fù)CrGGPP抑制后的表型，證明了CrGGPP在長(zhǎng)春花單萜吲哚生物堿類物質(zhì)的合成中具有重要作用。

4.3 酶基因過(guò)表達(dá)研究

基因過(guò)表達(dá)研究主要有兩種，一種是將目標(biāo)基因克隆到攜帶有強(qiáng)啟動(dòng)子和抗性篩選標(biāo)記等元件的載體上，然后轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，這樣宿主細(xì)胞會(huì)獲得較高量的目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。另一種則是病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)系統(tǒng)（virus mediated gene overexpression，VMGO）瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)。該技術(shù)亦可以將外源基因在植物體內(nèi)大量表達(dá)。通過(guò)分析目標(biāo)基因過(guò)表達(dá)后轉(zhuǎn)基因植物的表型，便可以研究該基因的功能。

Yuan等［36］對(duì)黃花蒿（Artemisia annua）中青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因—青蒿醛△11（13）雙鍵還原酶AaDBR2進(jìn)行過(guò)表達(dá)操作，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株青蒿素和其前體二氫青蒿酸的含量顯著提高，該研究為獲得高產(chǎn)青蒿素的黃花蒿代謝工程策略奠定了基礎(chǔ)。Chung等［37］從鬼針草（Bidens pilosa）挖掘到了油酸脫氫酶BpOD和脂肪酸乙炔酶BpFAA，通過(guò)病毒介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)，在鬼針草葉片中分別過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因，都可以提升聚炔類化合物的含量，表明兩種酶均可以催化長(zhǎng)鏈脂肪酸前體脫飽和，在天然活性產(chǎn)物聚乙炔的合成中作用顯著。為了研究銀杏（Ginkgo biloba）中黃酮類成分的生物合成途徑，Wu等［38］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從黃酮中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)類黃酮3'，5'-羥化酶GbF3'，5' H1。由于銀杏缺少成熟的轉(zhuǎn)基因材料的體系，為了研究該基因的功能，將GbF3'，5' H1于楊樹（Populus）中進(jìn)行過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株黃酮類成分櫻桃甙、表兒茶素、沒食子兒茶素的含量顯著高于野生型植株，表明GbF3'，5' H1在銀杏黃酮類成分的生物合成中發(fā)揮作用。

5 酶結(jié)構(gòu)解析與定向改造

確認(rèn)了催化酶在藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑中的功能后，為了探究酶發(fā)揮催化功能的機(jī)理或進(jìn)一步對(duì)酶催化功能進(jìn)行定向改造，首先需要對(duì)酶蛋白晶體進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，闡明底物選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，解釋酶催化底物的反應(yīng)機(jī)制。而后對(duì)發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，獲得一系列底物特異性或催化效率發(fā)生改變的突變體，對(duì)突變體的功能進(jìn)行解析，最終獲得特定功能的酶，實(shí)現(xiàn)酶功能的定向改造。

C-糖苷在自然界中分布局限、結(jié)構(gòu)多樣性不足，同時(shí)化學(xué)法C-糖基化面臨選擇性差，因此藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑中C-糖基轉(zhuǎn)移酶研究成為近些年來(lái)的熱點(diǎn)問(wèn)題。第一個(gè)被解析晶體結(jié)構(gòu)的C-糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)自于金蓮花（Trollius chinensis），He等［39］發(fā)現(xiàn)了催化黃酮C-8位糖基化的碳糖基轉(zhuǎn)移酶TcCGT1，研究表明該酶可以催化合成牡荊苷等36種碳苷類化合物。又初步闡明了TcCGT1催化C-、O-糖基化的分子機(jī)制，并通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)了由C-糖基化向O-糖基化的功能轉(zhuǎn)變。Zhang等［40］從光果甘草（Glycyrrhiza glabra）鑒定出一條雙C-糖基轉(zhuǎn)移酶GgCGT（UGT708B4）。該雙C-糖基轉(zhuǎn)移酶能夠高效催化含有弗洛丙酮結(jié)構(gòu)單元的化合物發(fā)生連續(xù)兩步的C-糖基化反應(yīng)，生成相應(yīng)的雙碳苷產(chǎn)物。為了闡明該酶的催化機(jī)制，解析了GgCGT分別與二磷酸尿苷葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖等底物結(jié)合后所形成復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于葡萄糖，半乳糖的結(jié)合位置的偏轉(zhuǎn)導(dǎo)致糖基部分與周圍氨基酸形成氫鍵作用的強(qiáng)弱發(fā)生變化，影響酶與糖供體的結(jié)合作用強(qiáng)弱，決定了糖基供體的偏好性的順序。Xie等［41］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法從蘆薈（Aloe barbadensis）中發(fā)掘了一個(gè)C-糖基轉(zhuǎn)移酶（AbCGT），該酶可以高效催化多種不含?；姆枷丬赵牡孜镞M(jìn)行C-糖基化。以GgCGT為模板，通過(guò)同源建模的方法構(gòu)建AbCGT的三維立體結(jié)構(gòu)，利用分子對(duì)接預(yù)測(cè)了該酶與底物2-羥基柚皮素的反應(yīng)口袋，發(fā)現(xiàn)183位的纈氨酸為酶關(guān)鍵活性位點(diǎn)催化殘基。通過(guò)定點(diǎn)將該位點(diǎn)突變天冬氨酸、谷氨酸或者脯氨酸后，AbCGT催化的底物選擇性有明顯提升。

6 合成生物學(xué)研究

由于多數(shù)藥用植物天然產(chǎn)物在原植物中積累較低，且獲得受到植物生長(zhǎng)狀態(tài)、采收時(shí)間、提取方法、遺傳操作困難等諸多因素的限制。因此，天然產(chǎn)物合成生物學(xué)則是基于工程化的原理，通過(guò)設(shè)計(jì)改造自然界已存在的微生物或植物，或者于這些生物體內(nèi)，重新構(gòu)建一套完整系統(tǒng)，高效快速的生產(chǎn)藥用植物活性成分。實(shí)現(xiàn)這一策略首先需要推測(cè)目標(biāo)天然產(chǎn)物的生物合成途徑，其次明確每一步催化反應(yīng)所需要的關(guān)鍵酶及輔因子，再將生物合成途徑整合于底盤細(xì)胞內(nèi)，最終對(duì)整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化調(diào)控。目前，藥用植物天然產(chǎn)物合成生物學(xué)常用的底盤有大腸桿菌、酵母及本氏煙草等，下文將針對(duì)不同底盤構(gòu)建細(xì)胞工廠進(jìn)行藥用天然產(chǎn)物的合成進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

Li等［42］通過(guò)來(lái)源于7個(gè)物種的11個(gè)基因整合進(jìn)大腸桿菌，構(gòu)建了能夠?qū)⒈奖彼峄蚶野彼醿煞N不同的前體，定向合成黃芩素或野黃芩素的菌株。后針對(duì)丙二酰輔酶A這一重要前體的供應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，搖瓶水平黃芩素和野黃芩素的產(chǎn)量分別達(dá)到了23.6 mg/L 和106.5 mg/L。Yao等［43］在丹參素生物合成途徑未被解析的情況下，利用大腸桿菌內(nèi)源的羥基化酶和植物乳桿菌中的D-乳酸脫氫酶，在大腸桿菌中構(gòu)建了丹參素生物合成途徑。再采取模塊化策略優(yōu)化，加強(qiáng)底物的供給；對(duì)底盤細(xì)胞編輯，敲除競(jìng)爭(zhēng)基因，篩選出高產(chǎn)丹參素的人工大腸桿菌，丹參素產(chǎn)量達(dá)7.14 g/L。

斯坦福大學(xué)的Christina課題組利用酵母實(shí)現(xiàn)了多種藥用植物活性天然產(chǎn)物的生物合成，其中最具代表性的工作便是2015年于釀酒酵母中合成蒂巴因和氫可酮，以及2020年在面包酵母中合成托品烷生物堿。Galanie等將來(lái)自酵母本身、植物、細(xì)菌以及嚙齒動(dòng)物的21種酶，在不影響酵母正常生長(zhǎng)的情況下，整合進(jìn)釀酒酵母中，通過(guò)輔因子循環(huán)利用、嵌合蛋白的蛋白質(zhì)折疊等方法，獲得了嗎啡類藥物的關(guān)鍵前體—蒂巴因。之后又整合了另外兩種催化酶，使得產(chǎn)生蒂巴因的酵母進(jìn)一步生成了氫可酮［12］。Prashanth通過(guò)5個(gè)生物合成功能模塊的設(shè)計(jì)，從糖和氨基酸出發(fā)，在面包酵母中實(shí)現(xiàn)了莨菪堿和東莨菪堿的合成［44］。

依托泊苷作為拓?fù)洚悩?gòu)酶 II 抑制劑，廣泛應(yīng)用于肺癌、睪丸癌、淋巴瘤和其它惡性腫瘤的化療。目前，依托泊苷主要從桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum）中分離鬼臼毒素，并以此為前體合成依托泊苷。但對(duì)桃兒七過(guò)度的砍伐導(dǎo)致其現(xiàn)已瀕臨滅絕。目前常用的替代方法是通過(guò)植物組織培養(yǎng)方法合成（-）-鬼臼毒素，并以此為前體合成依托泊苷，但該方法不便于進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。2015年Elizabeth課題組的Lau. W通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和代謝組的分析，解析了依托泊苷糖苷配基完整的生物合成途徑，并報(bào)道了其前體脫氧鬼臼毒素在煙草中的重構(gòu)，達(dá)到11.4±3.8 μg/g干重的產(chǎn)量，為煙草作為天然產(chǎn)物的生物合成底盤研究奠定了基礎(chǔ)，表明煙草的瞬時(shí)表達(dá)可以用于獲得毫克級(jí)的植物源小分子并生物合成其類似物［45］。2019年，同課題組的Schultz. BJ等利用煙草為底盤，實(shí)現(xiàn)了脫氧鬼臼毒素的異源合成。通過(guò)在煙草中表達(dá) 8 個(gè)松柏醇和 8 個(gè)依托泊苷苷元的酶基因之后，脫氧鬼臼毒素在煙草中的積累量達(dá)到了 4.3 mg/g。該研究表明可以在煙草植物底盤細(xì)胞中表達(dá)難培養(yǎng)的藥用植物中較長(zhǎng)的生物合成途徑，并達(dá)到毫克級(jí)產(chǎn)量［46］。

7 總結(jié)與展望

隨著藥用植物天然產(chǎn)物的市場(chǎng)需求的不斷增加，藥用植物的資源供求矛盾也越來(lái)越明顯，而通過(guò)生物技術(shù)手段是解決這一矛盾的有效方法。對(duì)藥用植物天然產(chǎn)物的生物合成化學(xué)原理和酶學(xué)機(jī)制進(jìn)行探究的最終目的，便是為藥用植物資源的可持續(xù)利用和發(fā)展提供一條全新而高效的途徑。

在生物信息學(xué)飛速發(fā)展的今天，通過(guò)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、表型組學(xué)等組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析，對(duì)藥用植物天然產(chǎn)物的生物合成途徑及關(guān)鍵催化酶進(jìn)行挖掘和解析，利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)對(duì)獲得的酶進(jìn)行改造，再應(yīng)用合成生物學(xué)的方法，將生物合成途徑和關(guān)鍵酶整合到底盤中，從而異源高效生產(chǎn)各種目標(biāo)天然產(chǎn)物。這一系列的研究方法，已經(jīng)成為藥物植物天然產(chǎn)物的生物合成研究的通用策略。

然而這一策略在應(yīng)用時(shí)也會(huì)遇到一些問(wèn)題。比如在研究一些關(guān)鍵催化酶的體內(nèi)功能時(shí)，由于許多藥用植物缺乏穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，只能借助模式植物瞬時(shí)轉(zhuǎn)化等手段進(jìn)行替代，所以仍需要在藥用植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究中加以突破。此外，植物的基因組中編碼了數(shù)目眾多且功能各異的催化酶，并且常以家族基因的形式存在，這些酶有的可以催化多種化合物的產(chǎn)生，有的只能催化單一天然產(chǎn)物的生成，還有的需要和其它酶或者輔因子共同作用才能發(fā)揮其催化效應(yīng)。這是由于在高等植物在進(jìn)化的過(guò)程中，酶的進(jìn)化形成了復(fù)雜而精巧的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其催化功能多樣性，進(jìn)而出現(xiàn)了物種的多樣性和代謝產(chǎn)物的多樣性。利用這一策略，不僅可以去探索未知天然產(chǎn)物的生物合成途徑及關(guān)鍵催化酶的功能，對(duì)于已知的途徑，仍可能會(huì)有全新的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)知。這一策略為更好的挖掘天然產(chǎn)物生物合成途徑提供了基礎(chǔ)，也將為合成生物學(xué)的研究提供豐富的元件，進(jìn)而推動(dòng)藥用植物天然產(chǎn)物提取、合成、臨床應(yīng)用等各領(lǐng)域的進(jìn)步。