冉鳳英 彭偉東 陳浩 武倫 羅丹 劉經(jīng)健 楊光義 梅全喜馮光軍 周文波 陳琴華

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院1實驗中心，2藥學(xué)部（湖北十堰442008）；3深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院藥學(xué)部（廣東深圳518101）

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，占所有癌癥的11.6%［1］。并且，肺癌也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，占全球所有癌癥相關(guān)死亡的18.4%［2］。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%～85%，而受檢測方法的限制，發(fā)現(xiàn)時患者大多發(fā)展為晚期了［3］。因此有待對找到可靠穩(wěn)定的早期診斷生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。研究［4］表明，外泌體在肺癌的診斷及治療中發(fā)揮了重要作用，外泌體為各種細(xì)胞分泌的直徑為30 ～200 nm的雙囊泡結(jié)構(gòu)［5］，普遍存在于血液、尿液、唾液、乳汁等體液中，攜帶多種脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞間的信息交流，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程［6-8］。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA 小分子，長度通常為18 ～24 個核苷酸［9］。研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的外泌體可以增強(qiáng)循環(huán)miRNA 的穩(wěn)定性，可反映來源供體細(xì)胞的疾病狀態(tài)，還可通過采取外周血進(jìn)行檢測［10-11］，故為腫瘤的早期診斷及治療提供了新的契機(jī)。本研究選擇了已有文獻(xiàn)報道肺癌血中表達(dá)升高的miR-221，選擇實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測NSCLC患者和健康對照組血漿外泌體miR-221 的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，初步探討其對肺癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018-2019年來湖北省十堰市國藥東風(fēng)總醫(yī)院就診的NSCLC 患者的血漿72 例和健康體檢人員的血漿52例，NSCLC 標(biāo)本為經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診的患者，其中男42 例，女30 例，年齡44 ～76 歲；根據(jù)美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)提出的《非小細(xì)胞肺癌指南》中的分期標(biāo)準(zhǔn)，可將NSCLC 標(biāo)本分為早期（Ⅰ、Ⅱ期）43 例，晚期（Ⅲ、Ⅳ期）29 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）在手術(shù)切除前，所有的NSCLC 患者均未進(jìn)行放療和化療等治療措施；（2）手術(shù)前生化指標(biāo)血常規(guī)、肝功、腎功能均正常；（3）所有受試者均無肺癌家族史；（4）近2年無其他呼吸系統(tǒng)疾病史。健康對照組標(biāo)本為體檢人員，排除高血壓、糖尿病等多種疾病，無全身各系統(tǒng)惡性腫瘤疾病病史，其中男30 例，女22 例，年齡39 ～70 歲。本研究經(jīng)國藥東風(fēng)總醫(yī)院倫理委員會審核，研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit 試劑盒購自德國Qiagen公司（77023），Trizol試劑購自美國Thermo Scientific 公司（10296010）；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑和RT-qPCR 德國Qiagen 公司（218161，218073）；抗體CD9 購自美國Abcam 公司（ab92726），抗 體TSG101 購自美國Abcam 公司（ab125011）；miRNeasy Serum/Plasma Spike-in control 購自德國Qiagen 公司（秀麗線蟲cel-miR-39，219610）；引物購自德國Qiagen 公司（218300）。

低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；透射電子顯微鏡（美國FEI 公司，Tecnai G220 TWIN）；熒光定量PCR 儀（澳大利亞Corbett Research 公司）；梯度PCR 儀（美國ABI 公司）；紫外可見分光光度計（日本Hitachi 公司）。

1.2.2 血漿外泌體的分離及鑒定臨床采集研究對像靜脈血約5 mL，500 g 離心取上清，標(biāo)記做好標(biāo)記后置于-80 ℃保存。室溫溶解血漿，4 ℃，3 000 r/min離心5 min，取上清即血漿標(biāo)本。采用ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit 試劑盒提取血漿外泌體，整個提取過程依據(jù)試劑說明書進(jìn)行操作。獲得的外泌體樣品采用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)，采用Western blot 檢測外泌體表面蛋白標(biāo)志物CD9、TSG101，采用Nanosight 檢測外泌體的粒徑分布和濃度。

1.2.3 血漿外泌體miRNA提取及濃度測定、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA首先向血漿外泌體樣品中加200 μL Trizol 裂解15 min，選擇硅膠模吸附柱提取純化外泌體miRNA，并使用ND-100UV 微量紫外分光光度計測定樣品的RNA 濃度及純度。選擇加尾法對提取的外泌體miRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA 樣品，采用SYBR 法，對外泌體miRNA 進(jìn)行定量檢測。本實驗采用相對定量法，外泌體樣品加入Trizol 裂解后，加秀麗線蟲的cel-miR-39 作為外源對照基因，采用△Ct 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（△Ct=Ct miR-221-Ct miR-39）。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，計量資料的非正態(tài)分布兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。miR-221 表達(dá)水平連續(xù)性變量若滿足正態(tài)性分布則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非連續(xù)性變量采用用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示。根據(jù)qRT-PCR 結(jié)果（2-△Ct）建立受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）法分析血漿外泌體miR-221 對非小細(xì)胞肺癌的診斷價值，并計算曲線下面積（area under curve，AUC）、特異性和靈敏度，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較72 例NSCLC 組中男42 例、女30 例，平均年齡（61.64 ± 1.01）歲；52 例健康對照組男30 例、女22 例，平均年齡（50.40 ± 4.03）歲。72 例NSCLC 組與52 例健康對照組間性別、年齡、吸煙史臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

表1 NSCLC 組和對照組臨床資料比較Tab.1 Comparison of characteristics between NSCLC group and control group

2.2 血漿外泌體鑒定本實驗對提取的血漿外泌體形態(tài)、直徑、標(biāo)志蛋白、濃度及粒徑分布進(jìn)行了鑒定。在透射電子顯微鏡下觀察到提取的外泌體直徑為100 nm 左右（圖1A），Western blotting 結(jié)果顯示對照組和肺癌組血漿外泌體均表達(dá)外泌體標(biāo)志性蛋白TSG101 和CD63（圖1B），Nanosight 檢測結(jié)果顯示外泌體的粒徑分布為123.6 ～241.8 nm，平均粒徑為159.4 nm，外泌體的總濃度為2.38×1011個顆粒/mL，見圖1C。

圖1 血漿外泌體鑒定Fig.1 Identification of plasma exosomes

2.3 兩組受試者血漿外泌體miR-221 表達(dá)水平比較健康對照組和NSCLC 組患者血漿外泌體miR-221 的表達(dá)水平見圖2，結(jié)果顯示NSCLC 組的miR-221 相對表達(dá)量3.651，（0.557，4.208）高于健康對照組1.310（0.079，1.388）。兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z= 4.887，P＜0.001）。

圖2 miR-221 在健康對照組和NSCLC 組血漿外泌體中的相對表達(dá)量Fig.2 The level of miR-221 analyzed in NSCLC patients and healthy controls

2.4 血漿外泌體miR-221對NSCLC 的診斷價值評估為進(jìn)一步評估血漿外泌體miR-221 在NSCLC與健康人之間的診斷價值，采用ROC 曲線進(jìn)行分析，見圖3。血漿外泌體miR-221曲線下面積AUC為0.758（95%CI：0.672～0.844，P＜0.001），敏感度為86%，特異度為66%。結(jié)果提示miR-221 的表達(dá)在NSCLC 中確有升高的趨勢，血漿外泌體中的miR-221 有望成為非小細(xì)胞肺癌潛在的生物標(biāo)志物。

圖3 血漿外泌體miR-221 表達(dá)量診斷非小細(xì)胞肺癌的ROC 曲線Fig.3 ROC curve of the diagnostic value of plasma exosomal miR-221 for NSCLC

2.5 血漿外泌體miR-221 與NSCLC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系收集72 例數(shù)據(jù)齊全的NSCLC 患者血漿外泌體臨床病理數(shù)據(jù)，見表2，miR-221 的表達(dá)量采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。在臨床病理因素中，NSCLC 組患者血漿外泌體miR-221的表達(dá)量與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P= 0.015）、局部浸潤程度（P= 0.045）以及TNM 分期（P= 0.011）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤病變大小差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 NSCLC 患者血漿外泌體miR-221 表達(dá)量與臨床病理參數(shù)關(guān)系Tab.2 The relationship between the expression of plasma exosomal miR-221 and the clinical pathological parameters in NSCLC patients M（P25，P75）

3 討論

外泌體是由多種細(xì)胞分泌的直徑為50 ～220 nm的膜性小囊泡［12］，在人體體液中廣泛存在，如：尿液、血清、血漿、胸腔積液、唾液和乳汁等［13］。外泌體包含多種生物分子，如：蛋白、脂質(zhì)、miRNA、mRNA 和lncRNA 等［14］，近年來研究［15-17］發(fā)現(xiàn)，外泌體能夠反映其來源細(xì)胞的生物學(xué)特性和細(xì)胞的疾病狀態(tài)，因此，外泌體被認(rèn)為是一種極具潛力的腫瘤早期診斷生物標(biāo)志物。

miRNA 是一種長度約為18 ～25 個核苷酸的單鏈、非編碼RNA 分子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞信號分子傳遞密切相關(guān)［18-19］，目前的研究表明外泌體中有大量miRNA 分子，且外泌體中的miRNA分子與全血中的miRNA 分子表達(dá)譜差異有統(tǒng)計學(xué)意義［10-20］。因此，研究外泌體中的miRNA 分子具有重要意義。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)miR-221 在非小細(xì)胞肺癌血漿外泌體中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系的相關(guān)報道。本研究首先采用透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)、Western blotting 檢測外泌體特異性蛋白TSG101 和CD63、Nanosight 檢測提取的外泌體濃度及粒徑分布，證明血漿中存在大量的外泌體。其次，通過對72 例NSCLC 和52 例健康對照者血漿外泌體RNA qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)miR-221在NSCLC 患者血漿外泌體中高表達(dá)，結(jié)果提示外泌體miR-221 可能與NSCLC 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，但這一結(jié)論尚需進(jìn)一步的實驗進(jìn)行驗證。血漿外泌體miR-221 曲線下面積AUC 為0.758（95%CI：0.672 ～0.844，P＜0.001），敏感度為86%，特異度為66%。結(jié)果提示血漿外泌體miR-221 對NSCLC 的診斷效能較高。最后，對NSCLC 臨床病理參數(shù)與miR-221 相對表達(dá)量的關(guān)系進(jìn)行了分析，NSCLC 組患者血漿外泌體miR-221 的表達(dá)量與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤程度以及TNM 分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤病變大小差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。綜上，血漿外泌體中miR-221 可能成為NSCLC 臨床診斷的特異生物標(biāo)志物。

近年來，隨著研究的深入，血清、血漿、組織及細(xì)胞中的miRNA 在NSCLC 中的研究越來越多，KANG 等［21］發(fā)現(xiàn)miR-211 在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平增加，并且miR-211 的過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲；GAO 等［22］發(fā)現(xiàn)miR-539 通過wnt8b 抑制NSCLC 細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示miR-539 可能是NSCLC治療的一種新的潛在診斷和治療靶點(diǎn)。隨著人們對外泌體作為腫瘤生物標(biāo)志物的不斷深入研究，外泌體中的miRNA 越來越成為研究的熱點(diǎn)，VALLABHAENI 等［23］發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過傳遞miR-21 和miR-34a，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；ZHOU 等［24］發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者血漿外泌體中的miR-19-3p、miR-21-5p 和miR-221-3p 表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為血漿中的miRNA 是肺腺癌診斷的潛在生物標(biāo)志物；此外，目前的一些研究也表明可以從NSCLC 患者的血清或血漿中成功分離外泌體，并采用qRTPCR 技術(shù)對其miRNA 進(jìn)行鑒定［25-26］。綜上所述，血漿外泌體中的miRNA 已成為一種新型的生物標(biāo)志物被廣泛研究，本研究已證明miR-221 在NSCLC患者血漿外泌體中高表達(dá)，對NSCLC 具有較好的診斷效能，后續(xù)將加大樣本量深入研究miR-221與NSCLC 的相關(guān)性，為其成為診斷非小細(xì)胞肺癌的新型生物標(biāo)志物提供更充分的理論依據(jù)。