李 磊

新汶礦業(yè)集團有限責(zé)任公司中心醫(yī)院藥學(xué)部，山東 泰安 271233

萹蓄為蓼科植物(polygonumaviculareL.)的干燥地上部分，全國大部分地區(qū)均有種植，夏季葉茂盛時采收，去除根和雜質(zhì)，曬干即可用于臨床。萹蓄藥材始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)2015年版《中國藥典》收錄，是一味常用中草藥，常用于熱淋澀痛，小便赤短，蟲積腹痛，皮膚濕疹等癥[1-2]。萹蓄的主要化學(xué)成分有黃酮類、酚酸類、苯丙素類、生物堿類、萜類等，目前對萹蓄的質(zhì)量控制研究主要集中在黃酮類和酚酸類化合物中，但同時測定萹蓄中理化性質(zhì)相差較大的幾種活性組分含量的研究報道較少[3-10]。為了全面控制萹蓄的質(zhì)量，本研究采用HPLC法，首次建立了一次進樣同時測定萹蓄藥材中綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等8種成分含量的方法，以期為萹蓄藥材的合理質(zhì)量控制提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；GR-202 型電子分析天平(日本And公司，精確到0.1 mg)；移液器(德國Eppendorf公司)；KQ-500型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH 恒溫水浴鍋(江蘇金壇國勝實驗儀器廠)；Ultimate XB-C18色譜柱(上海月旭Welch)。

1.2 試藥

槲皮素(批號AB17051802)、綠原酸(批號AB7070302)購自成都埃法生物科技有限公司；槲皮苷(批號wkq17081106)、楊梅苷(批號wkq17090808)、木犀草苷(批號wkq17070401)購自四川維克奇生物科技有限公司；咖啡酸(批號110885-200102)、金絲桃苷(批號111521-201205)、山奈素(批號11861-200606)購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，乙醇、磷酸為分析純，超純水。

三個批次萹蓄藥材產(chǎn)自河北保定，購自泰安市漱玉平民大藥房，由山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)孫立彥教授鑒定為蓼科植物萹蓄(polygonumaviculareL.)的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，純甲醇溶解制成含槲皮素2 mg/mL、金絲桃苷1 mg/mL、木犀草苷100 μg/mL、綠原酸1 mg/mL、山奈素 1 mg/mL、咖啡酸1.55 mg/mL、槲皮苷2 mg/mL、楊梅苷2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，然后都用純甲醇稀釋配制6個標(biāo)準(zhǔn)品系列質(zhì)量濃度。8種標(biāo)準(zhǔn)品貯備液各取50 μL，用純甲醇稀釋至1 mL，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 樣品溶液制備[2-5]

3批藥材樣品磨碎、過四號篩，各精密稱取0.5 g置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入60%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，冷浸 6 h，超聲30 min，60%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

2.3 色譜條件

Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.5%磷酸(B)，梯度洗脫(程序見表 1)；柱溫45 ℃；體積流量 1.0 mL/min；檢測波長360 nm；進樣量10 μL。HPLC色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液在“2.3”項色譜條件下測定，記錄色譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行回歸，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋，以 3倍信噪比確定檢測限，計算綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等8種化合物的回歸方程，結(jié)果表明各化合物的峰面積和質(zhì)量濃度之間均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。見表2。

2.5 精密度試驗

取同一批標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣6次，測得綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等峰面積RSD分別為0.58%、0.75%、0.36%、0.84%、0.64%、0.81%、0.43%、0.56%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

將樣品溶液在室溫下于 0、1、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，測得綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素峰面積RSD分別為0.46%、0.35%、0.56%、0.73%、0.62%、0.72%、0.85%、0.51%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

分別取同一批萹蓄，按“2.2”項下方法制備 6份樣品溶液，測得綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等峰面積RSD分別為1.24%、2.08%、1.76%、1.21%、2.59%、2.81%、3.26%、2.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的萹蓄粉末6份，每份約 0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入適量標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，測定加樣回收率。結(jié)果見表3，符合分析要求。

2.9 樣品含量測定

用“2.2”制備的樣品溶液，按“2.3”條件進行HPLC分析，測定各指標(biāo)成分的峰面積并計算含量，有關(guān)數(shù)據(jù)見表4。

表1 梯度洗脫程序

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC譜圖

表2 回歸方程及相關(guān)系數(shù)

表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

續(xù)表

表4 萹蓄中8種成分含有量檢測結(jié)果(%)

3 討 論

本研究對萹蓄藥材中的8種藥效成分進行了分析檢測，其中包括黃酮類化合物和酚酸類化合物，是首次對萹蓄中理化性質(zhì)相差較大的幾種活性組分含量的研究。對不同流動相進行了考察，包括甲醇-0.2%磷酸水和乙腈-0.5%磷酸水，最后確定乙腈-0.5%磷酸水及梯度洗脫條件。

2015年《中國藥典》萹蓄藥材的質(zhì)控指標(biāo)僅規(guī)定了楊梅苷，本研究也證明楊梅苷是萹蓄中含量最高的有效成分之一，河北保定產(chǎn)3批次萹蓄中楊梅苷含量均高于藥典0.03%的要求[1]。除楊梅苷外，本研究還同時檢測了萹蓄中其他7種有效成分，為全面評價和研究萹蓄藥材質(zhì)量、保障臨床用藥安全有效提高了有力支撐。

3批次萹蓄藥材中8種有效成分含量比重有差異，但基本一致的是含量最高的為楊梅苷，其次是咖啡酸、槲皮苷和槲皮素，較少的是綠原酸和山奈素，金絲桃苷和木犀草苷微量或者檢測不出。原因可能是藥材采收期、生長年限、存放條件和時間、取樣量部位的不同導(dǎo)致有效成分含量有差異。本次選取的萹蓄都是產(chǎn)自河北保定，產(chǎn)地不同也會導(dǎo)致有效成分含量的差異。而其中某些有效成分檢測不出可能因為取樣量少不易檢測或者在溶媒中溶解性不好。