呂曉明 阮淑蒙 宋增美 陳美華

山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)藥學院，山東 泰安 271016

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)表現(xiàn)為漸進性的認知能力及記憶力的減退，是發(fā)生在老年期的一種常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病隱蔽，早期診斷困難，β-淀粉樣蛋白沉積、膽堿能神經(jīng)元退行性變、Tau-蛋白過度磷酸化等假說是現(xiàn)今AD發(fā)病機制較為成熟的假說[1-2]。目前臨床用于AD治療的藥物仍然是膽堿酯酶抑制劑，這類藥物在一定程度上可減輕AD癥狀，但是并不能延緩或阻止AD病程的發(fā)展，且存在一定的副作用，因此尋找更加安全有效的抗AD藥物至關(guān)重要。蕓香苷是一種從植物中提取的黃酮類化合物，研究表明蕓香苷具有抗自由基活性、抗脂質(zhì)過氧化、抗病毒作用、抗腫瘤作用、抗心血管系統(tǒng)疾病和神經(jīng)保護等多種功能[3-5]。本研究采用腹腔注射東莨菪堿制備記憶障礙小鼠模型，研究蕓香苷對小鼠學習記憶能力的影響，并初步探討蕓香苷改善學習記憶的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

蕓香苷，上海源葉生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AchE)試劑盒購自南京建成生物工程研究所; Morris水迷宮實驗分析系統(tǒng)，上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 實驗動物與分組

實驗前1天用Morris水迷宮對小鼠進行篩選，將篩選合格小鼠隨機分成5組，正常組，模型組及蕓香苷高劑量組(40 mg/kg)、中劑量組(20 mg/kg)和低劑量組(10 mg/kg)，每天同一時間灌胃給藥，1次/d，連續(xù)14 d。

1.3 東莨菪堿誘導小鼠記憶障礙模型

根據(jù)文獻[6]制備東莨菪堿致癡呆小鼠模型，Morris水迷宮測試前30 min，模型組、蕓香苷藥物組(高、中、低劑量)小鼠均腹腔注射1 mg/kg東莨菪堿，正常組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 Morris水迷宮實驗[7]

定位航行實驗：實驗需連續(xù)5天，將小鼠依次從4個入水點放入池中，記錄逃避潛伏期。60 s內(nèi)未登上平臺的小鼠，逃避潛伏期為60 s。并計算小鼠的平均潛伏期?？臻g探索實驗：在Morris水迷宮實驗第6天，將水下平臺移去，記錄小鼠在目標象限滯留的時間及探索次數(shù)。

1.5 腦組織生化指標的測定

行為學實驗后，取腦組織，水制備10%勻漿液，4℃、3 000 r/ min，離心10 min，取上清液，測定腦組織SOD活性、MDA含量及AchE活性。

1.6 腦組織HE染色

取腦組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明，包埋，進行連續(xù)冠狀切片，常規(guī)HE染色，觀察腦組織病理形態(tài)學變化。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 學習記憶能力測試

定位航行實驗中，各組小鼠尋找安全平臺的能力隨訓練次數(shù)的增加逐漸提高，平均逃避潛伏期逐步縮短。與正常組相比，模型組小鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)。與模型組相比，中劑量組和高劑量組小鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)。見表1。

空間探索實驗中，與正常組相比，模型組小鼠在目標象限內(nèi)探索次數(shù)減少，游泳時間縮短(P<0.01)。與模型組相比，高劑量組小鼠在目標象限的探索次數(shù)和游泳時間明顯增加(P<0.01)，中、低劑量組小鼠的探索次數(shù)和游泳時間也增加(P<0.05)。見表2。

2.2 腦組織生化測定

與正常組相比，模型組小鼠腦組織SOD活性降低，MDA含量和AchE活性升高(P<0.05)。蕓香苷高、中、低劑量組小鼠腦組織SOD活性升高，MDA含量和AchE活性降低(P<0.05)。見表3。

2.3 腦組織HE染色

HE染色顯示，正常組小鼠海馬神經(jīng)細胞數(shù)量較多、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列緊密，細胞質(zhì)豐富，核仁明顯；模型組小鼠海馬神經(jīng)細胞數(shù)量減少，細胞形態(tài)不規(guī)則，核仁不明顯；給藥組小鼠海馬神經(jīng)細胞排列較整齊，與模型組比較，神經(jīng)元受損程度降低。見圖1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期

表2 各組小鼠空間探索實驗結(jié)果

表3 各組小鼠腦組織中SOD活性、MDA含量及AchE活性

A.正常組；B.模型組；C.高劑量組；D.中劑量組；E.低劑量組。

3 討 論

阿爾茨海默病是一種起病隱匿，伴有認知障礙和記憶喪失的神經(jīng)退行性疾病[8]。東莨菪堿誘導的記憶障礙模型是研究AD記憶損害的經(jīng)典模型，具有簡單方便、一致性好的特點，被廣泛用于益智藥物和抗AD藥物的初步篩選。東莨菪堿可阻斷M膽堿受體，抑制腦內(nèi)膽堿能信號功能，從而干擾學習獲得和短期記憶的過程[9]。Morris 水迷宮是一種檢測嚙齒類動物空間學習能力的最常用的測試方法，Morris 水迷宮實驗中，模型組尋找平臺時間明顯延長，空間探索實驗中穿臺次數(shù)和在目標象限游泳時間降低；蕓香苷可增加小鼠的穿臺次數(shù)和延長目標象限的游泳時間，說明蕓香苷可以改善小鼠的學習記憶能力。

Ach是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，對認知和學習記憶能力具有重要的調(diào)節(jié)作用，AD患者腦內(nèi)Ach減少是造成學習記憶損害的重要而直接的原因[10-11]。乙酰膽堿酯酶抑制劑抑制AchE,增加突觸間隙Ach含量，可改善AD患者的認知障礙，乙酰膽堿酯酶抑制劑仍然是目前治療AD的有效藥物[12]。本實驗中，蕓香苷可降低AchE活性，減少Ach的水解，通過降低AchE活性而增強腦內(nèi)的膽堿能神經(jīng)功能。

腦組織脂質(zhì)含量豐富，耗氧量高，容易受到氧自由基的損傷，廣泛的氧化應激是是AD病理進程中最早發(fā)生的事件[13]。過量生成的活性氧自由基(ROS)易使機體受到氧化損傷，研究表明，氧化應激與認知功能障礙之間存在明顯的相關(guān)性，在減少ROS藥物提高學習能力、改善記憶缺陷方面具有一定作用[14]。SOD活性、MDA含量可以綜合評價氧化應激水平，SOD可有效清除體內(nèi)ROS,其活性可反映機體的抗氧化能力，MDA是衡量機體細胞膜氧化損傷的重要標志，也有報道MDA異常增加與記憶損傷有一定的聯(lián)系[15-16]。本研究顯示，蕓香苷能提高SOD活性，降低MDA含量，說明其神經(jīng)保護作用與抗氧化作用密切相關(guān)。

綜上所述，蕓香苷對東莨菪堿誘導小鼠記憶障礙有明顯的保護作用，其機制涉及抗氧化和影響膽堿能神經(jīng)的活性。