張春雨，謝巖黎*，楊玉輝

1.河南工業(yè)大學(xué) 谷物資源轉(zhuǎn)化與利用省級重點實驗室，河南 鄭州 450001 2.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

隨著人們對營養(yǎng)健康食品的需求逐漸增大，含有花青素等天然抗氧化劑的食品受到消費者的青睞。食品工業(yè)中富含花青素的加工食品體系有較寬的pH值范圍，例如：山楂酒的pH值在2.3～2.5之間[1]，葡萄酒[2-3]、果汁[4-6]等產(chǎn)品的pH值在2.9～3.7之間，豆?jié){、面條等食品的pH值則可以達到6.4～7.3[7-8]。在加工過程中，為了使最終的產(chǎn)品具有一定的風(fēng)味和較長的貨架期，還引入了非常多的熱處理，如工業(yè)烹飪、熱燙、熱擠壓和熱殺菌等[9]。目前作者所在實驗室已經(jīng)針對黑豆的綜合利用開展了其在面制品方面的研究[10-11]，為了拓展黑豆皮花青素在食品及保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用，有必要研究花青素在較寬pH值范圍和不同溫度熱處理條件下的穩(wěn)定性和抗氧化活性，降低工業(yè)化處理導(dǎo)致的損失，達到最大程度保留花青素的目的。

pH示差法是實驗室常用的測定花青素含量的方法，該方法以強酸環(huán)境下花青素黃烊鹽陽離子在520 nm附近的吸光度為依據(jù)對花青素進行定量[12-13]。天然產(chǎn)物的抗氧化活性測定有多種方法，其中ABTS和DPPH自由基清除能力是實驗室常用的測定方法，兩種物質(zhì)的自由基都位于結(jié)構(gòu)中的N原子上[14]。由于不同方法之間抗氧化機理存在差異，且相同的方法也因試驗材料、試驗對象等的不同而具有細節(jié)上的差異，導(dǎo)致數(shù)據(jù)之間的橫向?qū)Ρ却嬖诶щy。鑒于此，作者探討了pH示差法在測定花青素液體時的局限性以及自由基種類對黑豆皮花青素抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，C3G)：純度98%，從黑龍江雙鴨山市出產(chǎn)的黑豆中分離提純，采用文獻[15]的方法制備；2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，98%)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，98%)：酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司；試驗中所用其他試劑均為分析純，所用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市華峰儀器有限公司；UV-6100S型紫外可見分光光度計:上海美譜達儀器有限公司；PHS-3C型pH計:上海雷磁儀器廠；DL-5-B型低速大容量離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 花青素樣品的制備

使用0.2 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉的緩沖液體系，分別取1 mg花青素固體溶于25 mL的pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0緩沖液，得到7個pH值的花青素溶液；取花青素溶液5 mL于25 mL玻璃試管中，分別在65、85、100 ℃下水浴加熱處理30 min后立即置于冷水中降至室溫，得到熱處理樣品。

1.3.2 pH示差法測定花青素含量

參考文獻[16]的方法，分別用0.2 mol/L的鹽酸-氯化鉀緩沖液和0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液配制pH 1.0、4.5的緩沖液，取上述花青素溶液樣品0.4 mL與3.2 mL緩沖液混合，平衡10 min后測定樣品在510、700 nm處吸光度A510、A700，每個樣品處理做3組平行試驗。

花青素含量按照下式[17]計算：

A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5，

式中：C為花青素含量，mg/L；A為吸光度；ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的吸光系數(shù)，26 900 L·mol-1·cm-1；F為稀釋因子；M為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol；d為光程，1 cm。

1.3.3 花青素抗氧化活性測定

1.3.3.1 ABTS清除率的測定

參考Van Den Berg等[18]的方法，并作適當(dāng)調(diào)整。

分別配制7 mmol/L ABTS水溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液作為儲備液，等體積混合兩種儲備液后在室溫下避光放置12～16 h，形成工作母液，使用無水乙醇將工作母液稀釋23倍后作為ABTS工作液。

分別量取2.85 mL ABTS溶液、0.15 mL花青素溶液，2.85 mL ABTS溶液、對應(yīng)pH值的空白緩沖液，2.85 mL無水乙醇、0.15 mL花青素溶液于10 mL離心管中，振蕩混勻后避光反應(yīng)10 min。未離心樣品組直接在734 nm處測定得到吸光度A1、A0和A2；離心樣品組經(jīng)3 000g離心5 min后在相同波長下測定吸光度A1、A0和A2。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測定

參考Brand-William等[19]的方法并作適當(dāng)修改。

取DPPH固體溶于無水乙醇得到80 μmol/L的DPPH工作溶液，然后分別量取2.85 mL DPPH溶液、0.15 mL花青素溶液，2.85 mL DPPH溶液、對應(yīng)pH值的空白緩沖液，2.85 mL無水乙醇、0.15 mL花青素溶液于10 mL離心管中，振蕩混勻后避光反應(yīng)30 min。未離心樣品組直接在515 nm處測定得到吸光度A1、A0和A2；離心樣品組經(jīng)3 000g離心5 min后在相同波長下測定吸光度A1、A0和A2。

上述兩種自由基清除率按照下式計算：

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件對測定數(shù)據(jù)進行匯總整理，用Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進行可視化，使用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析(ANOVA)及配對樣品T檢驗對數(shù)據(jù)進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖體系pH值對花青素含量測定的影響

在強酸環(huán)境下花青素黃烊鹽陽離子呈現(xiàn)出鮮艷的紅色，pH示差法主要是通過測定其在520 nm附近的吸光度判定溶液中花青素含量。當(dāng)被測體系不在強酸環(huán)境中，花青素在水溶液中主要存在黃烊鹽陽離子、甲醇假堿、查爾酮以及醌式堿4種結(jié)構(gòu)，4種結(jié)構(gòu)之間存在化學(xué)平衡[20-21]。因此，當(dāng)花青素受到熱加工等外界因素影響導(dǎo)致其無法以陽離子結(jié)構(gòu)存在，以pH示差法測定的花青素含量會降低。

試驗pH值范圍內(nèi)不同溫度熱處理后的花青素含量如表1所示?？筛鶕?jù)花青素含量的變化規(guī)律將pH值劃分成3個范圍：pH 2.0～4.0，花青素在各種加熱條件下保持相對穩(wěn)定，變化率?。籶H 5.0、6.0，花青素含量在特定加熱環(huán)境下出現(xiàn)升高的趨勢；pH 7.0、8.0，花青素含量隨著溫度升高而迅速降低。試驗結(jié)果主要是由花青素結(jié)構(gòu)隨pH環(huán)境變化而變化導(dǎo)致的：花青素在pH<4.0時主要以黃烊鹽陽離子結(jié)構(gòu)存在[22]，該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較好；在pH 5.0～6.0之間是黃烊鹽陽離子、查爾酮、甲醇假堿及醌式堿4種結(jié)構(gòu)共存的狀態(tài)，加熱雖然會導(dǎo)致一部分花青素降解成小分子或轉(zhuǎn)變成查爾酮，但由于其他結(jié)構(gòu)之間存在相互轉(zhuǎn)化，整體表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性；花青素在pH≥7.0的環(huán)境則以查爾酮和醌式堿結(jié)構(gòu)為主，這兩種結(jié)構(gòu)都是由黃烊鹽陽離子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化來的，二者之間不存在直接轉(zhuǎn)化途徑[20, 23]，因而溶液中殘留的花青素在此pH值環(huán)境下無法逆回到黃烊鹽陽離子結(jié)構(gòu)顯色，導(dǎo)致以pH示差法檢測的花青素含量下降。

表1 pH值對熱處理后花青素含量的影響Table 1 Effect of pH on anthocyanin content after heat treatment mg/L

2.2 緩沖液pH值及自由基種類對花青素抗氧化活性的影響

2.2.1 ABTS清除率

在測定花青素清除自由基能力時，離心處理對不同pH值環(huán)境熱處理后花青素ABTS清除率的影響如圖1所示。在未經(jīng)離心處理的樣品組中，pH 2.0～8.0范圍內(nèi)花青素對ABTS的清除率呈現(xiàn)倒“U”形的趨勢，圖1a、圖1b和圖1c中的花青素在pH 2.0時的清除率最低，pH 3.0～6.0之間的清除率較高且互相之間沒有顯著差異(P>0.05)，而pH值達到7.0和8.0時清除率降低且兩種環(huán)境無顯著差異(P>0.05)。圖1d仍具有倒“U”形的趨勢，但是兩種處理的樣品組清除率分別在pH 4.0、5.0時達到最高點。經(jīng)離心處理的樣品組中花青素對ABTS的清除率卻呈現(xiàn)類似“～”的波動趨勢，清除率在pH 4.0、5.0、8.0達到較高，pH 2.0環(huán)境的清除率最低。

注：不同的大寫字母表示離心處理樣品組不同pH環(huán)境之間具有差異性，不同的小寫字母表示未離心處理樣品組不同pH環(huán)境之間具有差異性，P<0.05。圖2同。圖1 緩沖液pH值對熱處理前后花青素ABTS清除率的影響Fig.1 Effect of buffer pH on ABTS free radical scavenging rate of anthocyanin before and after heat treatment

2.2.2 DPPH清除率

離心處理對不同pH值環(huán)境經(jīng)熱處理后花青素DPPH清除率的影響如圖2所示。在未經(jīng)離心處理的樣品組中，pH 2.0～8.0范圍內(nèi)花青素對DPPH的清除率呈現(xiàn)和圖1類似的倒“U”形趨勢，pH 2.0環(huán)境下的花青素對DPPH清除率也同樣是最低的。經(jīng)離心處理的樣品組對DPPH的清除率在25 ℃和65 ℃時呈現(xiàn)“M”形趨勢，而在85 ℃和100 ℃處理后則呈現(xiàn)倒“U”形趨勢，其清除率的最低點為pH 8.0環(huán)境。

對比上述兩種自由基試驗結(jié)果可以看到，花青素所處的pH值環(huán)境對花青素的自由基清除率有顯著影響(P<0.05)，但是熱加工對相同pH值環(huán)境下的自由基清除率卻只在個別條件下影響顯著(以離心組數(shù)據(jù)為基準(zhǔn))。這可能是因為pH值對花青素結(jié)構(gòu)有較大影響，而花青素各個結(jié)構(gòu)之間可以通過化學(xué)反應(yīng)維持相對平衡，雖然熱加工會導(dǎo)致一部分花青素發(fā)生降解，花青素依然可以通過一定的結(jié)構(gòu)動態(tài)平衡以及降解產(chǎn)物來發(fā)揮抗氧化活性[24-27]。另外，兩種自由基試驗表明，花青素的未離心組和離心組在pH 2.0時清除率基本一致，在pH 3.0～8.0環(huán)境下離心組花青素對DPPH的清除率遠低于未離心組，但pH 8.0環(huán)境下離心組花青素對ABTS清除率出現(xiàn)明顯上升且接近未離心組。同樣采用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖體系且以乙醇作為自由基溶劑的文獻[26, 28-29]并沒有提到離心處理。除了pH 2.0的樣品，其他pH值的花青素樣品加入自由基溶液后會出現(xiàn)明顯的白色渾濁，這是緩沖液中含有的不溶于乙醇的磷酸氫二鈉析出導(dǎo)致的，如果未經(jīng)離心處理直接測定會因為鈉鹽晶體對光路的遮擋作用導(dǎo)致吸光度增大，從而使得測定的花青素抗氧化活性增大。ABTS自由基溶液的吸光度在加入pH 8.0的緩沖液后顯著下降，比其他緩沖液的吸光度低約14%(從1.512下降到1.300)，這可能是導(dǎo)致pH 8.0環(huán)境的離心組樣品ABTS清除率異常升高的原因。

圖2 緩沖液pH值對熱處理前后花青素DPPH清除率的影響Fig.2 Effect of buffer pH on DPPH free radical scavenging rate of anthocyanin before and after heat treatment

3 結(jié)論

由于花青素在pH 2.0～8.0緩沖體系中存在黃烊鹽陽離子、甲醇假堿、查爾酮以及醌式堿4種結(jié)構(gòu)之間的化學(xué)平衡，導(dǎo)致以pH示差法檢測此范圍溶液中花青素含量出現(xiàn)偏差。

弱酸環(huán)境(pH 4.0～6.0)下花青素的自由基清除率顯著高于強酸及堿性環(huán)境，而熱處理對自由基清除率的影響較小?；ㄇ嗨貙煞N自由基的清除能力在pH>7.0的環(huán)境下出現(xiàn)顯著差別，可能與DPPH屬于氮自由基而ABTS屬于氮陽離子自由基有關(guān)。

緩沖液體系中含有的磷酸氫二鈉在乙醇中析出對光路產(chǎn)生物理阻擋，導(dǎo)致測定的未離心處理組抗氧化活性顯著高于離心處理組。