譚 楊，陳曉宇，郭 文，吳嘉穎，阿提坎·吾斯曼，曹 慧

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）亦可稱作冰結(jié)合蛋白（Ice binding proteins，IBPs）、冰結(jié)構(gòu)蛋白（ice structuring proteins，ISPs）[1]，是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱，不僅能夠降低生物體液的冰點，抑制冰晶的形成，還能改變冰晶的生長規(guī)律，抑制重結(jié)晶[2]，因此其在動植物組織以及細(xì)胞低溫保存、食物的貯藏等方面具有良好的市場前景[3-5]。到目前為止，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)從植物、魚類、陸地昆蟲、細(xì)菌等各類生物體中分離出多種抗凍蛋白[6-9]。由于較低的產(chǎn)率及較高的成本，科研工作者仍然試圖從各種資源中尋找新的AFP分子，篩選活性更強(qiáng)的組分。我國是畜禽生產(chǎn)和消費(fèi)大國，由于加工技術(shù)的落后，產(chǎn)生了大量下腳料，研究發(fā)現(xiàn)，畜禽下腳料富含的膠原蛋白中具有高活性的抗凍組分[10]，可能成為AFP的主要來源之一。目前，常采用多種色譜聯(lián)用技術(shù)對AFP進(jìn)行不同程度的篩選，該篩選過程繁瑣耗時，難以實現(xiàn)快速、高效篩選目的。近年來，隨著對AFP功能性質(zhì)研究的日益重視，已見一些利用冰晶吸附AFP的研究報道，如Kuiper等[11]通過“cold finger”吸附的冰晶分離AFP。與傳統(tǒng)的分離方法相比冰晶特異性親和吸附法有明顯優(yōu)勢。不足的是，該法對抗凍組分的吸附量小，產(chǎn)量很低。基于此，本研究以高寒地區(qū)的牦牛骨為原料制備酶解膠原蛋白，并采用改良的可大面積吸附抗凍組分的冰親和吸附法對其中的抗凍組分進(jìn)行高效吸附，同時研究其抗凍性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗中的原料為新鮮的牛大骨，由上海申宏冷藏儲運(yùn)有限公司提供；重組抗凍蛋白，購自武漢華美生物工程有限公司；市售抗凍蛋白，購自上海聚鑫生物科技有限公司；胃蛋白酶（酶活力為37200 U/g）、羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品等其他試劑均為分析純，購自國藥試劑集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HP-1100高效氨基酸分析儀，北京Agilent公司；J-715圓二色譜儀，上海Jasco公司；UV-6000 PC型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；J-20XP型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LD85B3型真空冷凍干燥機(jī)，美國millrock科技公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨脫鈣以及鈣含量的測定

選取10倍體積的0.25M EDTA·2Na作為脫鈣液對粉碎后的牛骨粉進(jìn)行脫鈣，每8 h更換一次脫鈣液。鈣含量測定依據(jù)《GB 5009.92—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測定》。

1.3.2 牛骨膠原的制備及提取率測定

脫鈣結(jié)束后過濾去掉脫鈣液，加入10倍體積0.5M醋酸溶液浸泡12 h；在醋酸浸泡后的骨粉溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的胃蛋白酶酶解48 h，離心沉淀，收集上清液；將上清液蒸發(fā)濃縮凍干，保存?zhèn)溆谩?/p>

依據(jù)《GBT 9695.23—2008肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》測定膠原蛋白含量。膠原蛋白提取率為提取獲得膠原蛋白總質(zhì)量與牛骨原料中膠原蛋白的總質(zhì)量之比。具體換算公式為

式中：A為羥脯氨酸的百分含量；M1為羥脯氨酸的質(zhì)量，ug；M2為樣品質(zhì)量，mg；B為膠原蛋白提取率。

1.3.3 膠原抗凍肽的制備

圖1 冰親和吸附裝置Fig. 1 Ice affinity adsorption device

在Knight等[12]，Zhang等[13]及阮功成等[14]的研究基礎(chǔ)上，搭建了由低溫恒溫槽、磁力攪拌器、酶反應(yīng)器及絕熱盒組成的冰親和吸附裝置，如圖1所示。具體吸附流程如下：先取一定量的純凈水倒入酶反應(yīng)器中，用低溫恒溫槽將溫度降到?4 ℃并恒溫20 min，預(yù)先在酶反應(yīng)器內(nèi)壁獲得2～4 mm厚的冰層，倒出酶反應(yīng)器中多余的水，將冰層在?4 ℃恒溫2 h。再將已降溫到0 ℃的酶解液倒入內(nèi)壁制備好冰層的酶反應(yīng)器中，開啟磁力攪拌器在相應(yīng)溫度下吸附一定時間。吸附完畢后，倒出吸附后的液體，然后將恒溫槽升溫至2 ℃，使酶反應(yīng)器內(nèi)壁上含有抗凍肽的冰晶充分溶解得到多肽溶液。在此基礎(chǔ)上，考察了吸附時間（2，4，6，8 h）、吸附溫度（?3，?2.5，?2，?1 ℃）和吸附濃度（1，2，3，4 mg/mL）對熱滯活性值的影響。

1.3.4 熱滯活性的測定

稱取約10 mg多肽溶液于鋁皿內(nèi)，并置于DSC儀器內(nèi)。當(dāng)儀器充滿液氮并穩(wěn)定后，首先以10 ℃/min的速率降溫至?30 ℃保持10 min，再升溫至10 ℃保持 5 min，獲得樣品溶液的熔融熱△Hm和熔點Tm。再以10 ℃/min將樣品降溫至?20 ℃保持5 min；然后以5 ℃/min升溫至樣品呈固液共存狀態(tài)，即到達(dá)其保留溫度Th，保持5 min；再將溫度以1 ℃/min的速率從Th降至 ?20 ℃。重復(fù)上述升降溫程序，在不同的Th下保持5 min，分別記錄樣品的起始結(jié)晶溫度T0以及結(jié)晶熱△Hr[15]，并分別按照式（1）計算熱滯活性THA值。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

采用SDS-PAGE電泳方法鑒定提取的牛骨膠原的純度，電泳條件如下：

分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%；濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%；電極緩沖液1 L：3 g Tris，14.4 g甘氨酸，1 g SDS，加蒸餾水至1 L；樣品緩沖液10 mL：0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 值6.8），5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%甘油，2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%的SDS，0.5 mL β-巰基乙醇，1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的溴酚藍(lán)，0.9 mL雙蒸水；固定液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的三氯乙酸；染色液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的考馬斯亮藍(lán)R-250溶液；脫色液：75 mL冰醋酸+50 mL甲醇+875 mL蒸餾水混合；直流穩(wěn)壓電源：電流10 mA；電泳時間3 h。

將maker和提取的牛骨膠原蛋白配制成1 mg/mL的溶液，置于沸水浴中煮沸 3 min，10000 r/min 離心1 min，取上清液待上樣，上樣量為10 μL。在120 V電壓下電泳完畢之后，用0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色過夜，加水脫色至背景沒有顏色后拍照。

1.3.6 原子力顯微分析

將40 μg/mL的5 μL的膠原溶液吸移到新剝離的云母板的中心，讓液滴自然鋪平，放入干燥器中自然涼干30 min 以上。將制備好的云母板置于樣品臺上進(jìn)行原子力顯微鏡觀察[16]，測試參數(shù)為：針尖為125 μL蝕刻硅，彈性常數(shù)20-80 Nm?1，掃描頭為A型，諧振頻率范圍200～400 Hz，成像模式為輕敲模式（tapping mode），所有圖像經(jīng)過自動平滑處理以消除慢掃描導(dǎo)致的低頻噪音。

1.3.7 氨基酸組成分析

將約200 mg左右膠原樣品稱入水解管中，加入6 mol/L HCL，抽真空并封口，并在110 ℃下水解24 h。將水解后的樣品轉(zhuǎn)移定容后過濾，取濾液在加NaOH的真空干燥器中蒸干，再加鹽酸復(fù)溶后，取樣上機(jī)測定。色譜條件：4.0×125 mm C18柱；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長338 nm，262 nm（Hypro）；流動相A為20 mmol醋酸鈉液，流動相B為20 mmol醋酸鈉液∶甲醇∶乙腈 =1∶2∶2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，實驗結(jié)果用Excel及Origin處理作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫鈣工藝的優(yōu)化

2.1.1 脫鈣劑濃度對脫鈣率以及膠原蛋白提取率的影響

牛骨中無機(jī)礦物質(zhì)含量高達(dá)53%，這些鈣質(zhì)緊緊附著于骨膠原之上，若不進(jìn)行脫鈣處理，牛骨難以被蛋白酶酶解，導(dǎo)致膠原蛋白溶出率低[17-18]。因而本研究考察了EDTA·2Na濃度（0.05，0.15，0.25 ，0.35 mol/L）對牛骨脫鈣率及膠原蛋白提取率的影響，脫鈣時間為48 h。由圖2可見，隨著脫鈣劑濃度的升高，脫鈣率逐漸增加。當(dāng)脫鈣劑濃度為0.25 mol/L時，脫鈣率可以達(dá)到91.88%；當(dāng)脫鈣劑濃度達(dá)到0.15 mol/L以上時，膠原蛋白的提取率達(dá)到比較穩(wěn)定的狀態(tài)。

采用原子力顯微鏡對不同濃度脫鈣劑脫鈣后的牛骨膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3所示。其中，圖3（a）、（c）、（e）為膠原微觀結(jié)構(gòu)平面圖，圖3（b）、（d）、（f）為膠原微觀結(jié)構(gòu)三維圖?？梢钥闯?，經(jīng)0.15 mol/L的脫鈣劑脫鈣后，牛骨中膠原結(jié)構(gòu)與其他兩組明顯不同，這可能是由于低濃度的脫鈣劑無法完全去除骨中的鈣質(zhì)，牛骨中鈣質(zhì)與蛋白緊密結(jié)合，在原子力測定過程中膠原蛋白難以聚集。因此在原子力顯微鏡結(jié)果中只能看到較小的聚集體。經(jīng)0.25 mol/L和0.35 mol/L的脫鈣劑脫鈣后，在原子力圖譜中明顯看到較大的聚集體，這可能是由于較高濃度的脫鈣劑使膠原蛋白從骨中完全游離出來，當(dāng)采用原子力顯微鏡觀察時，多肽鏈上疏水氨基酸殘基的疏水作用占優(yōu)勢，分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用增強(qiáng)，分子聚集成球形，從而形成較大的聚集體[16]。

圖3 脫鈣劑濃度對膠原蛋白的影響Fig.3 Effect of decalcification agent concentration on collagen

2.1.2 脫鈣時間對脫鈣率和提取率的影響

進(jìn)一步考察不同脫鈣時間（24 ，48，72 h）對骨料脫鈣率及膠原蛋白的提取率的影響，EDTA·2Na濃度初始設(shè)為0.15 mol/L。結(jié)果如圖4所示。由圖可見，隨著脫鈣時間的增加，脫鈣率也隨之增加，當(dāng)脫鈣時間為72 h時，脫鈣率達(dá)到最大，為87.10%。但隨著脫鈣時間的進(jìn)一步增加，膠原的提取率反而下降，在脫鈣時間為72 h時，膠原蛋白的提取率僅為13.54%，這可能是因為長時間的脫鈣可能導(dǎo)致骨料中的膠原蛋白發(fā)生流失，并隨脫鈣液一起被過濾除去。

采用AFM比較了不同脫鈣時間的膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，見圖5。其中圖5（a）、（c）、（e）為膠原微觀結(jié)構(gòu)平面圖，圖5（b）、（d）、（f）為膠原微觀結(jié)構(gòu)三維圖?？梢钥闯觯撯}24 h后獲得的膠原蛋白只能看到細(xì)絲狀的膠原纖維，沒有形成明顯的聚集體；而脫鈣48 h和72 h后，膠原蛋白能很好地自組裝成高度均勻有序的聚集體。綜合考慮脫鈣率和膠原蛋白提取率，脫鈣時間選為48 h。

圖4 脫鈣時間對脫鈣率的影響Fig. 4 Effect of decalcification time on decalcification rate and extraction efficiency

2.2 酶水解膠原蛋白的制備

圖5 脫鈣時間對膠原蛋白的影響Fig.5 Effect of decalcification time on collagen

采用胃蛋白酶對脫鈣后的物料進(jìn)行處理，考察酶解溫度（10，20，25，37 ℃）和時間（10，24，48，72 h）對膠原蛋白提取率的影響，其結(jié)果如圖6所示，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。由圖6可見，在酶解溫度為25 ℃時，膠原蛋白的提取率最高，達(dá)到48.53%。隨著酶解時間的增加，膠原蛋白的提取率增加，在酶解72 h后，膠原蛋白的提取率可以達(dá)到58.38%。這是因為長時間的酶解使牛骨中的膠原蛋白充分釋放。但考慮到長時間的酶解可能會使膠原蛋白酶解過度從而產(chǎn)生較多的短肽鏈，因此本研究選擇酶解時間為48 h。

圖6 不同酶解時間以及溫度對提取率的影響Fig. 6 Effect of enzymolysis time and temperatures on extraction efficiency

2.3 SDS-PAGE電泳

采用SDS-PAGE 法鑒定膠原蛋白的分子量及純度，結(jié)果如圖7所示，SDS-PAGE 圖譜上出現(xiàn)了α1，α2，β及γ4個條帶，其對應(yīng)的分子量分別約為90，100，110，200 kDa，這是典型的I型膠原蛋白SDS-PAGE圖譜。其中，在分子量約100 kDa附近出現(xiàn)了3個條帶，它們分別為膠原蛋白的α1，α2鏈，和α鏈的二聚體，即β-鏈；在高于200 KDa出現(xiàn)的條帶是α鏈的三聚體，即γ-鏈。圖譜上雜帶較少，說明采用胃蛋白酶法制備的膠原蛋白中小分子多肽較少，可見所獲得牛骨膠原蛋白具有較高的純度。

圖7 膠原蛋白SDS-PAGE 電泳圖（line1，line2重復(fù)）Fig. 7 SDS-PAGE electrophoresis of collagen before and after salting out

2.4 膠原酶解復(fù)合物的氨基酸組成

由表1可見，采用胃蛋白酶法制備的膠原酶解復(fù)合物的氨基酸組成中，Gly，Glu和Pro含量較高，其中每1000個氨基酸殘基中Gly殘基數(shù)為300，Glu和Pro殘基數(shù)分別為88和146；His、Tyr和Met含量較低；牛骨膠原蛋白中富含Pro、Gly和Hyp，這與膠原三股螺旋區(qū)由連續(xù)的Gly-X-Y重復(fù)序列組成相一致，其中X、Y是除Gly外的其他氨基酸殘基，X為Pro，Y為Hyp或羥賴氨酸。該結(jié)構(gòu)與雪蚤抗凍蛋白[19]的活性結(jié)構(gòu)域相似，因此以膠原蛋白為原料制備抗凍多肽具有可行性。

表1 膠原酶解復(fù)合物的氨基酸組成Tab.1 Amino acid composition of collagen

2.5 不同冰親和吸附條件下膠原抗凍肽的熱滯活性分析

利用抗凍蛋白能特異吸附于冰晶表面的原理，在前人研究基礎(chǔ)上，搭建了可增大吸附面積的冰親和吸附裝置（圖1），并應(yīng)用于酶解復(fù)合物中膠原抗凍肽的吸附。采用DSC法考察了不同吸附時間（2，4，6，8 h）、吸附溫度（?3，?2.5，?2，?1 ℃）以 及 吸 附 濃 度（1，2，3，4 mg/ml）對THA值的影響，結(jié)果如表2，圖7～9所示。

本研究首先對冰親和吸附的時間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如表2和圖8所示。在吸附4 h后蛋白得率達(dá)到最大，為49.30%。隨著吸附時間的增加，蛋白得率反而降低，這可能是由于過長的吸附時間導(dǎo)致冰晶表層吸附了大量雜質(zhì)，過長的吸附時間也導(dǎo)致抗凍肽的熱滯活性降低，在吸附時間為4 h時，獲得的膠原抗凍肽的熱滯活性值最大，為4.77 ℃，因此選擇其為最適吸附時間。

冰晶對膠原抗凍肽的吸附，不僅受吸附時間影響，還與吸附溫度有關(guān)。若吸附溫度過低會使得冰晶迅速結(jié)冰，冰層形成時間較短，從而影響膠原抗凍肽與冰晶的特異性吸附。結(jié)合表2和圖9可以發(fā)現(xiàn)，在?1 ℃時，所獲得的膠原抗凍肽的熱滯活性值最小，為0.57 ℃。這可能是由于當(dāng)吸附溫度較高時，水結(jié)冰的速度變慢，酶反應(yīng)器內(nèi)表面不能迅速形成新的吸附層。而此時酶反應(yīng)器內(nèi)壁事先制備好的冰層面已經(jīng)全部被膠原抗凍肽所飽和，阻隔了水與冰層的接觸，從而抑制了連續(xù)吸附的過程，導(dǎo)致所獲得的膠原抗凍肽熱滯活性降低。當(dāng)溫度達(dá)到?2 ℃時，熱滯后活性值達(dá)到最大為5.76 ℃，因此選擇其為最佳吸附溫度。

表2 不同吸附條件對熱滯活性（THA）以及蛋白得率的影響Tab.2 Effects of different adsorption conditions on thermal hysteresis activity and protein yield

圖8 吸附時間對抗凍蛋白熱滯活性的影響Fig. 8 Effect of adsorption time on thermal hysteresis activity of antifreeze proteins

圖9 吸附溫度對抗凍蛋白熱滯活性的影響Fig. 9 Effect of adsorption temperature on thermal hysteresis activity of antifreeze proteins

在相同吸附溫度及吸附時間下，考察了吸附濃度對膠原抗凍肽熱滯活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在吸附濃度為1 mg/mL時，蛋白得率較高，但熱滯活性值較小，僅為3.05 ℃；在吸附濃度為3 mg/mL和4 mg/mL時，熱滯活性值都較高，但蛋白得率有所降低；在吸附濃度為2 mg/ml時，蛋白得率和膠原抗凍肽的熱滯活性值均較高。這可能是由于在較高濃度的酶解液中，大量抗凍肽迅速吸附到冰晶層表面，延緩了新冰層的形成，從而減少了雜蛋白的吸附，在降低蛋白得率的同時，提高了熱滯活性。

圖10 吸附濃度對抗凍蛋白熱滯活性的影響Fig. 10 Effect of adsorption concentration on thermal hysteresis activity of antifreeze proteins

結(jié)合以上結(jié)果可以得出冰親和吸附裝置的最佳吸附條件為：吸附時間4 h，吸附溫度?2 ℃，吸附濃度2 mg/mL；此條件下的熱滯活性值5.76 ℃，蛋白得率48.1%。根據(jù)熱滯活性大小可將現(xiàn)有的抗凍蛋白分成兩類，即低熱滯活性抗凍蛋白和高熱滯活性抗凍蛋白，低熱滯活性抗凍蛋白的THA值一般在0.2～0.5 ℃之間，高熱滯活性抗凍蛋白的THA值一般在0.5～4.1 ℃之間[20-23]。我們制備的牛骨抗凍肽THA值為5.76 ℃，表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗凍性能，將來可作為一種新型的生物抗凍劑。

3 結(jié) 論

以EDTA·2Na作為脫鈣劑對牛骨進(jìn)行脫鈣，得到最佳脫鈣工藝：脫鈣時間為48 h，脫鈣濃度為0.25 mol/L。在此條件下，脫鈣率可達(dá)到87.10%，膠原蛋白提取率可達(dá)到43.99%。牛骨脫鈣后用胃蛋白酶進(jìn)行酶解制備牛骨膠原肽，在酶解時間為48 h，酶解溫度為25 ℃時，膠原蛋白提取率可達(dá)48.53%。進(jìn)一步考察了冰親和吸附過程中，吸附時間、吸附溫度以及吸附濃度對膠原肽THA值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：最佳吸附時間為4 h，吸附溫度為-2 ℃，吸附濃度為2 mg/ml。在此條件下，熱滯活性值為5.76 ℃，蛋白得率為48.1%。牛骨膠原蛋白營養(yǎng)豐富且呈現(xiàn)出良好的抗凍性能，在食品工業(yè)上具有良好的市場前景。