張青嫻，徐引弟，王治方，朱文豪，焦文強，李海利

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）是豬多發(fā)性漿膜炎和關節(jié)炎（Glasser's disease， 格拉瑟病）的病原體，常定植在豬的上呼吸道，在環(huán)境應激和感染免疫抑制性疾病時副豬嗜血桿菌進入血液暴發(fā)本病，引發(fā)全身性細菌感染[1]。

HPS至少分為15種血清型，我國流行的血清型為1、4、5和13，河南省以4型和5型居多[2-6]。目前防控本病的主要措施是使用抗生素和疫苗接種，常用的疫苗為全細菌滅活苗，但只對血清型1、4、5和6有保護力[7-9]。血清型之間的交叉保護不一致，也缺乏區(qū)分感染豬和疫苗豬的可用方法，當疫苗株與臨床分離株血清型不一致時，疫苗無法提供足夠的免疫保護。HPS血清型被視為毒力的重要標志，根據(jù)Oliveira等[10]的方法，不同血清型的HPS被分為3類：強毒力（血清型1、5、10、12、13和14）、中等毒力（血清型2、4和15）和無毒力（血清型3、6、7、8、9和11）。不同血清型的副豬嗜血桿菌分離株可攜帶不同的毒力基因，相同血清型的分離株也可表現(xiàn)出不同程度的毒力[11-13]。

目前HPS致病性毒力因子的數(shù)量與功能尚未完全探究清楚。樂敏首次繪制出HPS SH0165株基因組的潛在毒力因子圖，篩選出部分主要的毒力相關基因或操縱子基因（nanH、oapA、ompP5、pilA、ompP2、cdtABC、hhdAB、prtC、sodAC、sphB、espP、fkpA、mip、mviN和HAPS-0694），發(fā)現(xiàn)這些基因在我國HPS流行菌株中高度保守，很有可能是引起HPS致病力的關鍵因子[14]。研究發(fā)現(xiàn)，lsgB基因只存在于毒性菌株中[15]；capD基因編碼一種多糖生物合成蛋白，且與副豬嗜血桿菌的毒性有關[16]；wza基因在毒力因子莢膜多糖轉(zhuǎn)運過程起重要作用，缺失wza基因能使HPS毒力顯著降低[17]；體內(nèi)感染條件下，cdtABC和hhdAB均出現(xiàn)上調(diào)表達，是HPS直接發(fā)揮細胞毒性作用的重要武器[14]；vta3在毒力菌株和無毒力菌株中均高度保守，而vta1和vta2主要在致病菌株中為陽性[18]；HPS具有神經(jīng)氨酸酶基因nanH和神經(jīng)氨酸酶活性[19]，與細菌黏附有關的外膜蛋白ompP2在毒力株中存在部分堿基缺失[20-21]，而胞外絲氨酸蛋白酶（extracellular serine protease,espP2）在HPS感染過程中表達[22]。對田間分離株檢測毒力基因，并分析毒力基因與血清型的相關性，有助于預測HPS分離株的致病力和防控格拉瑟病。

本試驗通過對河南省HPS血清型分型和毒力基因擴增試驗，分析毒力因子的功能及其與血清型的相關性，為進一步認識該菌致病機理及研發(fā)新型亞單位疫苗和診斷試劑提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

受試菌株分離于2017—2018年河南地區(qū)具有典型格拉瑟病癥狀的病豬，由河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所傳染病研究室分離、鑒定與保存，共計46株HPS（表1）。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），美國BD公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），Sigma公司；革蘭氏染色液，珠海貝索生物技術有限公司；新生牛血清，鄭州益康生物工程有限公司；PCR分子生物學試劑，寶生物（大連）工程有限公司；DMSO和甘油等普通化學試劑，北京陸橋技術股份有限公司。

1.3 血清分型

參考Howell等[23-24]的方法，合成用于鑒定HPS血清型的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系共25 μL，包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix，上下游引物（50 μmol/L）各1.5 μL，2 μL DNA模板（濃度約20 ng/μL），0.25 μL DMSO和7.25 μL超純水。PCR反應條件：94 ℃初始變性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進行觀察分析。

表1 46株HPS分離株的背景信息

1.4 毒力基因鑒定

參考樂敏等[14，25-26]的方法，合成鑒定HPS毒力因子的引物（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系共25 μL，包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix，上下游引物（50 μmol/L）各2 μL，7.5 μL超純水和1 μL DNA模板（濃度約20 ng/μL）。反應體系如下：94 ℃初始變性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物。

表2 毒力基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 副豬嗜血桿菌的分離情況

根據(jù)分離部位統(tǒng)計，2017—2018年河南省副豬嗜血桿菌的分離率在肺組織中最高（47.8%，22/46），其次是氣管（37%，17/46），心血、腦組織和關節(jié)分離率均不高（表3）。

表3 副豬嗜血桿菌分離株在不同樣品中的血清型分離率

2.2 副豬嗜血桿菌的血清型分布

46株HPS一共鑒定出7種血清型（表3）。血清型5/12（32.6%，15/46）最常見，其次是血清型4（26.1%，12/46）、血清型7（15.2%，7/46），血清型2和血清型13均分離到3株（6.5%，3/46），血清型6分離到1株（2.2%，1/46），血清型11分離到2株（4.3%，2/46），未分離到血清型1、3、8、9、10、14和15，有3株為未定型菌株（6.5%，3/46）。

2.3 副豬嗜血桿菌的毒力基因測定

46株HPS的毒力基因分布情況見表4，wza（4/46，8.7%）分離率很低，只出現(xiàn)在強毒株中。lsgB（5/46，10.8%）、capD（4/46，8.7%）分離率低，且在高、中等毒力菌株中呈陽性。vta2（22/46，47.8%）、vta3（16/46，34.8%）、hhdA（24/46，52.2%）、hhdB（25/46，54.3%）、cdtA（24/46，52.2%）、cdtB（28/46，60.8%）、cdtC（26/46，56.5%）分離率較高，且均存在于強毒株或中等毒力菌株中。vta1、nanH、ompP2、espP2在分離株中陽性率較高，陽性率分別為73.9%（34/46）、67.4%（31/46）、80.4%（37/46）和56.5%（26/46），且無毒力區(qū)分。強毒株所含毒力基因最多，其次是中等毒力毒株。

表4 副豬嗜血桿菌血清型相關的毒力基因分布信息

2.4 血清型與毒力基因的關系

所有血清型的菌株至少攜帶1個毒力基因（表4）。毒力菌株與某些毒力基因的存在有很強的相關性。試驗顯示，無毒力菌株一般只含有vta1、ompP2、nanH和espP2基因，大多數(shù)毒力基因分布在高度和中等毒力組（表4）。相比之下，中等和無毒力性菌株出現(xiàn)vta3的概率非常低，中高度毒力菌株與lsgB、capD、vta1有很強的相關性。

3 討論

2017—2018年從河南省不同地區(qū)具有典型格拉瑟病癥狀的病豬中分離到46株HPS，其血清型和毒力基因分布呈現(xiàn)多樣性和復雜性。肺臟和氣管為HPS主要分離部位，血清型5氣管檢出率高于肺組織，而血清型4肺組織檢出率高于氣管。血清型分型結(jié)果顯示，HPS河南分離株流行的血清型為4型和5型，未分離到血清型1、3、8、9、10、14和15，與河南省副豬嗜血桿菌歷年流行的血清型一致[3-6]。心血、腦組織和關節(jié)的分離率很低，但其分離株均為中等毒力或強毒株，肺臟的高分離率提示2017—2018年HPS在河南省仍以強毒株流行為主[27]。

所篩選的14個毒力基因多存在于強毒株和中等毒力株中，無毒力株一般只含有vta1、ompP2、nanH和espP2基因。vta1、nanH、ompP2、espP2在河南省HPS流行菌株中高度保守，在毒力菌株和無毒力菌株中均存在，推測所篩選的毒力基因很有可能是HPS致病關鍵因子。由此推測可能存在多個毒力基因協(xié)同作用，使HPS菌株產(chǎn)生相對較高的毒力，對毒力基因的檢測可以作為將HPS血清型分為不同毒力組的補充方法。HPS毒力因子的界定將大幅提高毒力和非毒力菌株的鑒別，需要更多的研究來驗證副豬嗜血桿菌各毒力蛋白的具體作用[26，28]。

綜上所述，本研究分離的46株HPS多數(shù)含有多個毒力基因，可能存在多個毒力基因的協(xié)同作用，是否上述毒力因子是決定HPS致病力的基因還有待于進一步的基因敲除與回歸試驗驗證[29]；是否被界定為中等和強毒株的血清型中均含有上述毒力基因有待進一步擴大田間分離株范圍[30-31]。

本文提供了2017—2018年河南省HPS血清型和毒力基因的第一手資料，研究了血清型與毒力基因的相關性，對了解河南省HPS流行病學特征和防控該病具有重要意義。