張青嫻，徐引弟，王治方，朱文豪，焦文強(qiáng)，李海利

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）是豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎（Glasser's disease， 格拉瑟?。┑牟≡w，常定植在豬的上呼吸道，在環(huán)境應(yīng)激和感染免疫抑制性疾病時副豬嗜血桿菌進(jìn)入血液暴發(fā)本病，引發(fā)全身性細(xì)菌感染[1]。

HPS至少分為15種血清型，我國流行的血清型為1、4、5和13，河南省以4型和5型居多[2-6]。目前防控本病的主要措施是使用抗生素和疫苗接種，常用的疫苗為全細(xì)菌滅活苗，但只對血清型1、4、5和6有保護(hù)力[7-9]。血清型之間的交叉保護(hù)不一致，也缺乏區(qū)分感染豬和疫苗豬的可用方法，當(dāng)疫苗株與臨床分離株血清型不一致時，疫苗無法提供足夠的免疫保護(hù)。HPS血清型被視為毒力的重要標(biāo)志，根據(jù)Oliveira等[10]的方法，不同血清型的HPS被分為3類：強(qiáng)毒力（血清型1、5、10、12、13和14）、中等毒力（血清型2、4和15）和無毒力（血清型3、6、7、8、9和11）。不同血清型的副豬嗜血桿菌分離株可攜帶不同的毒力基因，相同血清型的分離株也可表現(xiàn)出不同程度的毒力[11-13]。

目前HPS致病性毒力因子的數(shù)量與功能尚未完全探究清楚。樂敏首次繪制出HPS SH0165株基因組的潛在毒力因子圖，篩選出部分主要的毒力相關(guān)基因或操縱子基因（nanH、oapA、ompP5、pilA、ompP2、cdtABC、hhdAB、prtC、sodAC、sphB、espP、fkpA、mip、mviN和HAPS-0694），發(fā)現(xiàn)這些基因在我國HPS流行菌株中高度保守，很有可能是引起HPS致病力的關(guān)鍵因子[14]。研究發(fā)現(xiàn)，lsgB基因只存在于毒性菌株中[15]；capD基因編碼一種多糖生物合成蛋白，且與副豬嗜血桿菌的毒性有關(guān)[16]；wza基因在毒力因子莢膜多糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程起重要作用，缺失wza基因能使HPS毒力顯著降低[17]；體內(nèi)感染條件下，cdtABC和hhdAB均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，是HPS直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的重要武器[14]；vta3在毒力菌株和無毒力菌株中均高度保守，而vta1和vta2主要在致病菌株中為陽性[18]；HPS具有神經(jīng)氨酸酶基因nanH和神經(jīng)氨酸酶活性[19]，與細(xì)菌黏附有關(guān)的外膜蛋白o(hù)mpP2在毒力株中存在部分堿基缺失[20-21]，而胞外絲氨酸蛋白酶（extracellular serine protease,espP2）在HPS感染過程中表達(dá)[22]。對田間分離株檢測毒力基因，并分析毒力基因與血清型的相關(guān)性，有助于預(yù)測HPS分離株的致病力和防控格拉瑟病。

本試驗(yàn)通過對河南省HPS血清型分型和毒力基因擴(kuò)增試驗(yàn)，分析毒力因子的功能及其與血清型的相關(guān)性，為進(jìn)一步認(rèn)識該菌致病機(jī)理及研發(fā)新型亞單位疫苗和診斷試劑提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

受試菌株分離于2017—2018年河南地區(qū)具有典型格拉瑟病癥狀的病豬，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所傳染病研究室分離、鑒定與保存，共計(jì)46株HPS（表1）。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），美國BD公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），Sigma公司；革蘭氏染色液，珠海貝索生物技術(shù)有限公司；新生牛血清，鄭州益康生物工程有限公司；PCR分子生物學(xué)試劑，寶生物（大連）工程有限公司；DMSO和甘油等普通化學(xué)試劑，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.3 血清分型

參考Howell等[23-24]的方法，合成用于鑒定HPS血清型的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共25 μL，包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix，上下游引物（50 μmol/L）各1.5 μL，2 μL DNA模板（濃度約20 ng/μL），0.25 μL DMSO和7.25 μL超純水。PCR反應(yīng)條件：94 ℃初始變性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進(jìn)行觀察分析。

表1 46株HPS分離株的背景信息

1.4 毒力基因鑒定

參考樂敏等[14，25-26]的方法，合成鑒定HPS毒力因子的引物（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共25 μL，包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix，上下游引物（50 μmol/L）各2 μL，7.5 μL超純水和1 μL DNA模板（濃度約20 ng/μL）。反應(yīng)體系如下：94 ℃初始變性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

表2 毒力基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 副豬嗜血桿菌的分離情況

根據(jù)分離部位統(tǒng)計(jì)，2017—2018年河南省副豬嗜血桿菌的分離率在肺組織中最高（47.8%，22/46），其次是氣管（37%，17/46），心血、腦組織和關(guān)節(jié)分離率均不高（表3）。

表3 副豬嗜血桿菌分離株在不同樣品中的血清型分離率

2.2 副豬嗜血桿菌的血清型分布

46株HPS一共鑒定出7種血清型（表3）。血清型5/12（32.6%，15/46）最常見，其次是血清型4（26.1%，12/46）、血清型7（15.2%，7/46），血清型2和血清型13均分離到3株（6.5%，3/46），血清型6分離到1株（2.2%，1/46），血清型11分離到2株（4.3%，2/46），未分離到血清型1、3、8、9、10、14和15，有3株為未定型菌株（6.5%，3/46）。

2.3 副豬嗜血桿菌的毒力基因測定

46株HPS的毒力基因分布情況見表4，wza（4/46，8.7%）分離率很低，只出現(xiàn)在強(qiáng)毒株中。lsgB（5/46，10.8%）、capD（4/46，8.7%）分離率低，且在高、中等毒力菌株中呈陽性。vta2（22/46，47.8%）、vta3（16/46，34.8%）、hhdA（24/46，52.2%）、hhdB（25/46，54.3%）、cdtA（24/46，52.2%）、cdtB（28/46，60.8%）、cdtC（26/46，56.5%）分離率較高，且均存在于強(qiáng)毒株或中等毒力菌株中。vta1、nanH、ompP2、espP2在分離株中陽性率較高，陽性率分別為73.9%（34/46）、67.4%（31/46）、80.4%（37/46）和56.5%（26/46），且無毒力區(qū)分。強(qiáng)毒株所含毒力基因最多，其次是中等毒力毒株。

表4 副豬嗜血桿菌血清型相關(guān)的毒力基因分布信息

2.4 血清型與毒力基因的關(guān)系

所有血清型的菌株至少攜帶1個毒力基因（表4）。毒力菌株與某些毒力基因的存在有很強(qiáng)的相關(guān)性。試驗(yàn)顯示，無毒力菌株一般只含有vta1、ompP2、nanH和espP2基因，大多數(shù)毒力基因分布在高度和中等毒力組（表4）。相比之下，中等和無毒力性菌株出現(xiàn)vta3的概率非常低，中高度毒力菌株與lsgB、capD、vta1有很強(qiáng)的相關(guān)性。

3 討論

2017—2018年從河南省不同地區(qū)具有典型格拉瑟病癥狀的病豬中分離到46株HPS，其血清型和毒力基因分布呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性。肺臟和氣管為HPS主要分離部位，血清型5氣管檢出率高于肺組織，而血清型4肺組織檢出率高于氣管。血清型分型結(jié)果顯示，HPS河南分離株流行的血清型為4型和5型，未分離到血清型1、3、8、9、10、14和15，與河南省副豬嗜血桿菌歷年流行的血清型一致[3-6]。心血、腦組織和關(guān)節(jié)的分離率很低，但其分離株均為中等毒力或強(qiáng)毒株，肺臟的高分離率提示2017—2018年HPS在河南省仍以強(qiáng)毒株流行為主[27]。

所篩選的14個毒力基因多存在于強(qiáng)毒株和中等毒力株中，無毒力株一般只含有vta1、ompP2、nanH和espP2基因。vta1、nanH、ompP2、espP2在河南省HPS流行菌株中高度保守，在毒力菌株和無毒力菌株中均存在，推測所篩選的毒力基因很有可能是HPS致病關(guān)鍵因子。由此推測可能存在多個毒力基因協(xié)同作用，使HPS菌株產(chǎn)生相對較高的毒力，對毒力基因的檢測可以作為將HPS血清型分為不同毒力組的補(bǔ)充方法。HPS毒力因子的界定將大幅提高毒力和非毒力菌株的鑒別，需要更多的研究來驗(yàn)證副豬嗜血桿菌各毒力蛋白的具體作用[26，28]。

綜上所述，本研究分離的46株HPS多數(shù)含有多個毒力基因，可能存在多個毒力基因的協(xié)同作用，是否上述毒力因子是決定HPS致病力的基因還有待于進(jìn)一步的基因敲除與回歸試驗(yàn)驗(yàn)證[29]；是否被界定為中等和強(qiáng)毒株的血清型中均含有上述毒力基因有待進(jìn)一步擴(kuò)大田間分離株范圍[30-31]。

本文提供了2017—2018年河南省HPS血清型和毒力基因的第一手資料，研究了血清型與毒力基因的相關(guān)性，對了解河南省HPS流行病學(xué)特征和防控該病具有重要意義。