鄭宵陽, 王余廣, 李博, 劉睿楠, 李崢, 萬靜茹, 王東旭, 張?zhí)煊? 叢厚義

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率和死亡率也居高不下，早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療至關(guān)重要。近年來，隨著人們對健康的重視程度不斷增高及影像技術(shù)的發(fā)展，越來越多的肺磨玻璃結(jié)節(jié)(ground-glass opacity nodules，GGO-nodules)被檢出[1,2]。GGO結(jié)節(jié)術(shù)后病理多為腺癌，并遵守一種循序漸進(jìn)的惡變發(fā)展方式[3]。近年來隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，許多與肺腺癌病理和預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)[4]、Ki67[5]、蛋白酪氨酸磷酸酶PKM2蛋白[6]及絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型 ( serine protease inhibitor Kazal 1，SPINK1)[7]等。通過研究這些分子標(biāo)志物的表達(dá)水平，可以幫助判斷患者預(yù)后和制定臨床治療方案。然而，目前這些分子標(biāo)志物的檢測都是有創(chuàng)性的，需通過獲得活體組織標(biāo)本，結(jié)合病理診斷結(jié)果才能完成。因此，非侵襲性預(yù)測這些分子標(biāo)志物的表達(dá)對肺腺癌的精準(zhǔn)診療具有重要意義，尤其是對于那些有臨床特征但不能接受有創(chuàng)性檢查的患者。影像檢查具有方便、快速、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)[8]。已有多篇研究報道MSCT征象對預(yù)測GGO結(jié)節(jié)肺腺癌患者的EFGR突變具有一定意義[9-11]，然而在預(yù)測Ki67、PKM2、SPINK1這些重要分子標(biāo)志物上還較少有研究報道。因此，本研究旨在通過探討GGO結(jié)節(jié)肺腺癌的MSCT征象與Ki67、PKM2、SPINK1表達(dá)間的相關(guān)性，以期為術(shù)前無創(chuàng)性評估肺腺癌預(yù)后以及疾病的臨床診治提供參考。

材料與方法

1.病例資料

搜集2018年9月-2020年6月于本院行手術(shù)治療的肺腺癌患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理診斷為肺腺癌；②術(shù)前行MSCT平掃，影像表現(xiàn)為磨玻璃結(jié)節(jié)；③術(shù)前未行放、化療等前期輔助治療；④無縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移；⑤臨床、病理及影像學(xué)資料完整。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在肺炎等其他肺部疾病或肺部先天性疾??；②患有其他部位惡性腫瘤；③有胸廓手術(shù)史；④合并心、腦、肝、腎疾病或其他全身性疾病。最終納入80例患者，其中男58例，女22例，年齡47～78歲，平均(57.60±8.27)歲。本研究獲本院醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均自愿加入本研究，并簽署了知情同意書。

2.檢查方法

MSCT檢查采用東芝aquillon 64排128層螺旋CT，胸部CT掃描范圍為肺尖至膈底，掃描參數(shù)：管電流100～200 mA，管電壓120 kV，矩陣512×512，螺距1.2，重建層厚1.0 mm，層間距0.5 mm，數(shù)據(jù)傳輸至PACS系統(tǒng)及后處理工作站進(jìn)行重建。掃描前訓(xùn)練患者憋氣，囑患者掃描時吸一口氣憋住，避免呼吸運(yùn)動造成的偽影對位于肺底的結(jié)節(jié)評估產(chǎn)生影響。應(yīng)用西門子三維后處理軟件MM Reading及分析軟件Oncology處理發(fā)現(xiàn)的結(jié)節(jié)，進(jìn)行圖像重建，測量并記錄結(jié)節(jié)大小、實(shí)性部分最大徑、類型(單純性GGN、混合性GGN)、個數(shù)(單發(fā)、多發(fā))、形態(tài)、邊緣及內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征(包括分葉、毛刺、血管集束、空泡、胸膜凹陷、充氣支氣管征)。由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的放射診斷醫(yī)師共同閱片，結(jié)果有分歧時通過協(xié)商達(dá)成一致。

3.免疫組織化學(xué)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

取術(shù)后病理組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)檢測Ki67、PKM2、SPINK1蛋白表達(dá)水平，試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。Ki-67表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色，染色程度越深得分越高，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色細(xì)胞所占比例越高得分越高，陰性為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最后將染色程度分值與染色細(xì)胞比例分值相乘得到最終分值，<3分為低表達(dá)，≥3分為高表達(dá)。PKM2表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，染色程度計分中無染色為0分，弱染色(淺黃色)為1分，中度染色(黃棕色)為2分，強(qiáng)染色(棕色)為3分；染色細(xì)胞所占比例計分中未見陽性細(xì)胞為0分，<25%為1分，25～50%為2分，50～75%為3分，>75%為4分；染色指數(shù)=染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞比例，以染色指數(shù)中位數(shù)(8分)為分界點(diǎn)，<8分為PKM2無表達(dá)或低表達(dá)，≥8分為PKM2高表達(dá)。SPINK1表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，染色程度越深得分越高，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色細(xì)胞所占比例越高得分越高，陰性為 0 分，1%～10% 為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。以染色強(qiáng)度得分和細(xì)胞比例得分的乘積為判斷標(biāo)準(zhǔn)，<3分為低表達(dá)，≥3分為高表達(dá)。

圖1 浸潤性腺癌患者，男，49歲，Ki67高表達(dá)，MSCT示左肺上葉結(jié)節(jié)(箭)分葉征。 圖2 微浸潤性腺癌患者，女，46歲，Ki67高表達(dá)，MSCT示右肺下葉結(jié)節(jié)(箭)分葉征。 圖3 浸潤性腺癌患者，女，53歲，PKM2高表達(dá)，MSCT示右肺下葉不規(guī)則結(jié)節(jié)(箭)、分葉征和胸膜凹陷征。 圖4 浸潤性腺癌患者，男，50歲，PKM2高表達(dá)，MSCT示右肺上葉不規(guī)則結(jié)節(jié)(箭)、分葉征和胸膜凹陷征。 圖5 微浸潤性腺癌患者，男，50歲，SPINK1高表達(dá)，MSCT示右肺上葉混合性GGN(箭)、分葉征和胸膜凹陷征。 圖6 浸潤性腺癌患者，女，54歲，SPINK1高表達(dá)，MSCT示右肺上葉混合性GGN(箭)、分葉征和胸膜凹陷征。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；定性資料以頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。對單因素分析結(jié)果中有意義的因素進(jìn)行二元Logistic分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.病理及免疫組化結(jié)果

80例肺腺癌患者中，浸潤性腺癌52例，微浸潤腺癌13例，原位腺癌5例。腫瘤直徑0.6～3.1 cm，平均(1.69±0.42) cm。Ki67高表達(dá)46例(57.5%)，低表達(dá)34例(42.5%)；PMK2高表達(dá)42例(52.5%)，低表達(dá)38例(47.5%)；SPINK1陽性45例(56.3%)，陰性35例(43.7%)。

2.Ki67、PKM2、SPINK1蛋白表達(dá)水平與MSCT征象間的關(guān)系

Ki67的表達(dá)水平與MSCT征象中的結(jié)節(jié)單發(fā)或多發(fā)、有無分葉征有關(guān)，Ki67高表達(dá)患者中出現(xiàn)多發(fā)結(jié)節(jié)、分葉征的比例顯著高于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而其他MSCT征象與Ki67的表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P>0.05，表1，圖1、2)。

表1 Ki67蛋白表達(dá)水平與MSCT征象間的關(guān)系

PKM2的表達(dá)水平與MSCT征象中的形態(tài)、有無分葉征、胸膜凹陷征及實(shí)性部分最大徑有關(guān)，PKM2高表達(dá)患者中出現(xiàn)不規(guī)則形結(jié)節(jié)、分葉征和胸膜凹陷征的比例均顯著高于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且前者的實(shí)性部分最大徑顯著高于后者，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而其他MSCT征象與PKM2的表達(dá)水平均統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P>0.05，表2，圖3、4)。

表2 PMK2蛋白表達(dá)水平與MSCT征象間的關(guān)系

SPINK1的表達(dá)水平與MSCT征象中的結(jié)節(jié)類型、有無分葉征和胸膜凹陷征有關(guān)，SPINK1高表達(dá)患者中出現(xiàn)混合性GGN、分葉征和胸膜凹陷征的比例均顯著高于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而其他MSCT征象與SPINK1的表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P>0.05，表3，圖5、6)。

表3 SPINK1蛋白表達(dá)水平與MSCT征象間的關(guān)系

3.二元Logistic回歸分析

對單因素分析中的變量賦值(表4)，分別以Ki67、PKM2、SPINK1表達(dá)水平為因變量(低表達(dá)=0；高表達(dá)=1)，以各自單因素分析結(jié)果中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量作為自變量，進(jìn)行二元Logistic分析。Logistic分析結(jié)果顯示，MSCT征象中出現(xiàn)分葉征是肺腺癌Ki67高表達(dá)的獨(dú)立危險因素(P<0.05)，出現(xiàn)分葉征和胸膜凹陷征是PKM2高表達(dá)的獨(dú)立危險因素(P<0.05)，出現(xiàn)分葉征和胸膜凹陷征是肺腺癌PKM2高表達(dá)的獨(dú)立危險因素(P<0.05，表5)。

表4 MSCT征象各變量的賦值

表5 Logistic回歸分析結(jié)果

討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，已成為癌癥死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌約占全部肺癌的80%，而肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中最常見的組織學(xué)亞型。由于肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，并且尚不明確，近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多學(xué)者致力于對肺腺癌病理和預(yù)后分子標(biāo)志物進(jìn)行研究，以期找到肺腺癌分子靶向治療的突破點(diǎn)。Ki67是一種與增殖細(xì)胞有關(guān)的核抗原，對判斷腫瘤的惡性程度及侵襲力有一定意義。最近的一項研究結(jié)果顯示，隨著肺腺癌患者Ki67表達(dá)水平增高，患者的復(fù)發(fā)率增高，總生存率降低，并且預(yù)后不良[12]，所以研究者認(rèn)為Ki67蛋白高表達(dá)肺腺癌患者術(shù)后應(yīng)盡可能予以積極治療。PKM2是一種代謝酶，可激活糖酵解和脂質(zhì)合成，并且PKM2還可在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中作為信號調(diào)節(jié)因子。相關(guān)研究顯示PKM2在肺腺癌組織中表達(dá)增高，下調(diào)PKM2的表達(dá)可抑制肺腺癌的腫瘤生長和侵襲，并且PKM2的高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)[13]。SPINK1的主要生理作用是抑制胰蛋白酶原等多種絲氨酸蛋白酶原活性，拮抗胰腺等組織的“自身消化”；相關(guān)研究表明，SPINK1與表皮細(xì)胞生長因子結(jié)構(gòu)相似，可通過自分泌形式激活表皮細(xì)胞生長因子信號傳導(dǎo)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。相關(guān)研究結(jié)果表明，SPINK1可促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞的增殖，并且SPINK1表達(dá)升高提示患者預(yù)后不良[7,14]。因此，這些分子標(biāo)志物都是與肺腺癌預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物，而通過探討GGO結(jié)節(jié)肺腺癌的MSCT征象與Ki67、PKM2、SPINK1表達(dá)之間的相關(guān)性，可為術(shù)前無創(chuàng)性評估肺腺癌預(yù)后提供一定參考依據(jù)。

本研究單因素分析結(jié)果顯示，Ki67的表達(dá)水平與MSCT征象中的結(jié)節(jié)單發(fā)或多發(fā)、有無分葉征有關(guān)，PKM2的表達(dá)水平與MSCT征象中的形態(tài)、有無分葉征、胸膜凹陷征及實(shí)性部分最大徑有關(guān)，SPINK1的表達(dá)水平與MSCT征象中的結(jié)節(jié)類型、有無分葉征和胸膜凹陷征有關(guān)。進(jìn)一步的多因素分析結(jié)果表明出現(xiàn)分葉征是肺腺癌Ki67高表達(dá)的獨(dú)立危險因素，出現(xiàn)分葉征和胸膜凹陷征是PKM2高表達(dá)的獨(dú)立危險因素，出現(xiàn)分葉征和混合性GGO結(jié)節(jié)是肺腺癌PKM2高表達(dá)的獨(dú)立危險因素。以上結(jié)果提示，分葉征和胸膜凹陷征的出現(xiàn)對判斷肺腺癌預(yù)后分子標(biāo)志物的表達(dá)水平至關(guān)重要。

分葉是指腫塊的輪廓表面通常呈現(xiàn)起伏不平的多個弧形，而并非呈現(xiàn)規(guī)則的圓形或橢圓形，形似多個融合在一起的結(jié)節(jié)。分葉征出現(xiàn)的病理學(xué)基礎(chǔ)包括以下幾個方面：肺的結(jié)締組織間隔、進(jìn)入腫瘤的血管或支氣管分支、從腫瘤內(nèi)向外生長的血管和結(jié)締組織等引起腫瘤生長受限；腫瘤邊緣各部位腫瘤細(xì)胞的分化程度不一，生長速度不同；腫瘤內(nèi)部纖維組織的收縮[15]。相關(guān)研究表明，惡性GGO結(jié)節(jié)更容易出現(xiàn)分葉征，而惡性程度高的腫瘤往往也預(yù)后較差[16,17]。胸膜凹陷征的主要病理基礎(chǔ)是瘤內(nèi)纖維化，而纖維母細(xì)胞在腫瘤血管形成中扮演至關(guān)重要的角色。新發(fā)腫瘤病灶內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)相對而言缺乏完整性，且血管內(nèi)皮的間隙較大，因此更容易使血液中的纖維蛋白原滲入組織間隙，從而生成纖維母細(xì)胞；此外，惡性腫瘤細(xì)胞增殖旺盛，組織內(nèi)缺氧會導(dǎo)致腫瘤病灶產(chǎn)生纖維化收縮，從而使得胸膜凹陷征的發(fā)生概率進(jìn)一步增高[18]。相關(guān)研究表明，胸膜凹陷征也是良惡性GGO結(jié)節(jié)鑒別的一個重要征象，在惡性GGO結(jié)節(jié)中胸膜凹陷征的出現(xiàn)比例顯著增高[18]。因此，分葉征和胸膜凹陷征在一定程度上反映了肺腺癌的不良預(yù)后，是預(yù)后的重要預(yù)測因素。然而，本研究也存在一些局限性，本研究樣本量不大，這可能會對結(jié)果的穩(wěn)健性產(chǎn)生一定影響，在未來有條件的情況下，我們會納入更多患者，以得到更準(zhǔn)確的研究結(jié)果。

綜上所述，MSCT征象中的分葉征和胸膜凹陷征有助于預(yù)測磨玻璃結(jié)節(jié)樣肺腺癌Ki67、PKM2、SPINK1的表達(dá)狀態(tài)，從而為疾病的預(yù)后評估和臨床診治提供參考依據(jù)。