于 芝，吳茜萍，焦華杰，汪 婷，徐卉芳

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是最常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加[1]。該疾病會(huì)影響大多數(shù)65歲以上的人，是老年人行動(dòng)能力受損的主要肌肉骨骼原因[2]。膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是骨關(guān)節(jié)炎最常見(jiàn)的類(lèi)型[3]。右美托咪定(DEX)是一種快速作用的-2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等多種功效，目前被臨床廣泛應(yīng)用[4-5]，同時(shí)DEX兼具有抗炎作用，DEX在KOA的治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值，但目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步明確右美托咪定在KOA治療中的價(jià)值及其機(jī)制，筆者設(shè)計(jì)了本次研究，旨在為DEX治療KOA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本次研究于2019年1-12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)完成。人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞購(gòu)自Scien Cell公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天(C1062S)，蛋白抗體p-Smad3(bs-2225R)購(gòu)自Bioss公司，蛋白抗體Bcl(12789-1)、Bax(50599-2)、Beclin(11306-1)、TGF-β1(21898-1)、Smad3(25494-1-AP)、P62(18420-1)、LC3(14600-1)以及HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(SA00001-2)購(gòu)自Proteintech公司。

1.2 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)：人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)條件：37 ℃培養(yǎng)箱，5% CO2；細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)液+10%FBS+1%雙抗，細(xì)胞融合達(dá)到70%左右進(jìn)行傳代。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分為正常對(duì)照組(n=3)、模型組(n=3)、DEX治療組(n=3)。正常對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不做任何特殊處理；模型細(xì)胞加入10 ng/mL脂多糖體外構(gòu)建關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥模型[6]；DEX治療組細(xì)胞加入0.01 μmol/L DEX，30 min后加入10 ng/mL脂多糖。

1.4 細(xì)胞CCK8增殖檢測(cè)：3組細(xì)胞分別接種于96孔板中，每空104個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)重復(fù)，分別于接種后的24、48、72 h加入10% CCK8工作液，37 ℃孵育2 h 后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度值，記錄數(shù)據(jù)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：0.25%胰酶消化，離心(300 g，5 min)，PBS洗滌收集各組細(xì)胞，70%乙醇固定30 min，PBS離心洗滌3次，加入凋亡檢測(cè)工作液，4 ℃避光反應(yīng)30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。每組樣本重復(fù)3次。

1.6 Western-blot凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)：0.25%胰酶消化，300 g離心5 min。PBS洗滌收集各組細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞，BAC測(cè)定總蛋白濃度，在95 ℃ 加熱變性。SDS凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳室溫封閉1 h，4 ℃一抗[Bcl(1∶3 000)、Bax(1∶5 000)、LC3(1∶2 000)、P62(1∶5 000)、Beclin(1∶3 000)、Smad3(1∶1 000)、TGF-β1(1∶3 000)]孵育過(guò)夜。第二日PBST洗膜后，室溫二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，1∶10 000)孵育1h，ECL曝光檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用ImageJ軟件對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞增殖率檢測(cè)情況：CCK83組細(xì)胞增殖檢測(cè)，模型組隨著時(shí)間的增加細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，模型組72 h 細(xì)胞OD值較正常對(duì)照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=84.50，P<0.05)，而DEX組72 h 細(xì)胞OD值較模型組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.64，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組細(xì)胞不同時(shí)間增殖率比較(OD值,

2.2 3組細(xì)胞凋亡、自噬檢測(cè)：正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(2.10±0.10)%，模型組為(22.30±0.36)%，DEX組為(12.07±0.38)%，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.40，P<0.05)。模型組細(xì)胞與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=93.51，P<0.05)；DEX組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=44.08，P<0.05)；模型組與DEX組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.90，P<0.05),見(jiàn)圖1(封三)。

凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)，模型組與正常對(duì)照組比較，抗凋亡蛋白Bcl2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)；DEX組與模型組比較Bcl2表達(dá)下調(diào)，而B(niǎo)AX蛋白表達(dá)上調(diào)。

自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)，模型組與正常對(duì)照組比較，LC3-Ⅱ蛋白、Beclin-1蛋白表達(dá)下調(diào)，p62蛋白表達(dá)上調(diào)；DEX組與模型組比較，LC3-Ⅱ蛋白、Beclin-1蛋白表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)上調(diào)。

2.3 3組細(xì)胞TGF-β/Smad通路蛋白表達(dá)檢測(cè)：Western-blot法檢測(cè)3組細(xì)胞TGF-β/Smad通路蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示模型組細(xì)胞TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組表達(dá)上調(diào)；DEX組TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)較模型組表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖2(封三)。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎，是導(dǎo)致成年患者殘疾的主要原因[7]，其中膝關(guān)節(jié)是受影響最嚴(yán)重的關(guān)節(jié)。KOA形態(tài)學(xué)變化以軟骨退行性變、破壞,軟骨下骨硬化、囊變及滑膜炎癥等為主,臨床主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)積液甚至是關(guān)節(jié)功能受限[8]。相關(guān)文獻(xiàn)資料顯示，外傷、炎癥等多種因素導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡、功能障礙是KOA發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[9]，而TGF-β,IGF以及 Wnt 等信號(hào)通路在這一過(guò)程中起到了重要作用[10]。

細(xì)胞自噬和凋亡分別控制細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)以及有機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的更替，許多應(yīng)激途徑依次誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡。自噬是一個(gè)高度保守的真核細(xì)胞循環(huán)過(guò)程，自噬通過(guò)細(xì)胞質(zhì)、蛋白質(zhì)和大分子的降解以及分解產(chǎn)物的回收利用，正常情況下自噬的基礎(chǔ)水平保證了衰老和受損細(xì)胞器的生理更新，在細(xì)胞存活和維持中發(fā)揮重要作用，應(yīng)激條件下自噬的激活是細(xì)胞層面的適應(yīng)性反應(yīng)，而這一過(guò)程的功能障礙導(dǎo)致了許多人類(lèi)疾病的發(fā)生[11]。細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡之間的復(fù)雜相互作用決定了組織損傷的程度和疾病的進(jìn)展，一般來(lái)說(shuō)，自噬阻斷了細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，而凋亡的激活則阻斷了自噬過(guò)程。

本研究通過(guò)構(gòu)建軟骨細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)模型組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著增加，而細(xì)胞自噬受到抑制。Western-blot法進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組TGF-β1、Smad3及p-Smad3蛋白較對(duì)照組表達(dá)上調(diào)，表明模型組TGF-β/Smad通路被激活；而DEX組較模型組比較細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞自噬水平增加，TGF-β/Smad通路受到抑制，表明DEX通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞TGF-β/Smad信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞自噬而抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，DEX通過(guò)下調(diào)TGF-β/Smad信號(hào)通路促進(jìn)人軟骨細(xì)胞自噬而抑制炎癥誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明DEX在延緩KOA發(fā)展及治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。