劉 麗，張 新，李 成，代 雯，李佳琦，尹 東

慢性牙周炎是常見的口腔疾病，在我國患病率高達(dá)96.80%[1]。目前慢性牙周炎的治療方法仍然是基礎(chǔ)治療、手術(shù)治療及藥物治療。臨床上常用的藥物多為全身口服、含漱劑等抗生素類，雖能快速改善癥狀，但藥效維持時(shí)間短[2]；中藥亦能有效改善癥狀，且毒副作用小。中藥有效部位的提取方法很多，其中超聲萃取是一種非常有效的方法[3]。高效液相色譜法(HPLC)測(cè)中藥有效成分及濃度，具有高效、高靈敏度、分析速度快以及載液流速快等特點(diǎn)[4]。細(xì)胞膜色譜法(CMC)能夠在特定的活性細(xì)胞膜篩選模型上直接確定與膜受體發(fā)生結(jié)合的中藥某種活性部位和活性成分，進(jìn)一步進(jìn)行分離和鑒定，從而達(dá)到快速、高效和準(zhǔn)確篩選的目的[5]。牙周膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)是體外研究牙周組織的良好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚6]。辛伐他汀(SIM)對(duì)牙周組織的抗炎和再生有直接或間接作用[7]，適宜濃度SIM能促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞(hPDLC)增殖、ALP活性以及細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化，且可能與ERK、Wnt、BMP信號(hào)通路有關(guān)[8]。本研究通過HPLC聯(lián)合CMC法對(duì)牙周膜細(xì)胞膜與中藥三七的有效成分進(jìn)行篩選，以期能對(duì)牙周炎防治的新藥開發(fā)做初步的篩藥實(shí)驗(yàn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：Hair生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(BB16)(德國 Heraeus)，倒置相差顯微鏡(日本 Nikon)；細(xì)胞膜色譜柱芯組件(10 mm柱長(zhǎng)，2 mm 內(nèi)徑，0.22 μm 篩板孔徑)(深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司)；RPL-ZD10型裝柱機(jī)(大連日普利科技儀器有限公司)；VICI AG 10G-0911V10通切換閥(美國 Valco儀器公司)；Concentrator真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國eppendorf公司)；Shim-pack VP-ODS液相色譜柱預(yù)柱(10 mm柱長(zhǎng)，1 mm 內(nèi)徑，5 μm 粒徑，C18鍵合硅膠固定相)(日本Shimzdzu公司)；LC-MS-2010EV 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀系統(tǒng)(包括2部 LC-20 液相色譜泵，Shim-pack VP-ODS 高效液相色譜柱，SPD-20A UV 檢測(cè)器，SPD-M20A DAD 檢測(cè)器)。

1.2 試藥：三七購自于國大藥房(經(jīng)鑒定為三七)，試藥辛伐他汀(SIM)對(duì)照品(中國北京藥品生物制品檢驗(yàn)所，純度≥98%)；陽性藥物對(duì)照品人參皂苷Rb1編號(hào)：R-012，人參皂苷Rg1編號(hào)：R-010(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，純度≥98%)；胎牛血清、培養(yǎng)基DMEM、胰蛋白酶(GIBCO，美國)；乙腈，甲醇為色譜純(Fisher，美國)；ZEX-Ⅱ大孔硅膠(青島美高貿(mào)易有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 藥物制備：三七粉末10 g，用40 mL的甲醇-水(70∶30，v/v)溶液超聲提取30 min×3次，取上清液真空干燥，色譜甲醇復(fù)溶得到三七的甲醇總提取物，2 mL去離子水使其完全溶解，再依次加入極性不同的有機(jī)溶劑(石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯)各10 mL，超聲提取30 min×3次，分別收集6種部位的提取液，干燥后甲醇復(fù)溶、過濾。

1.3.2 hPDLC/CMC色譜柱制備：將4～8代hPDLC用10 mL Tris-HCl低滲液制備成細(xì)胞膜懸液5 mL動(dòng)態(tài)加入裝有活化硅膠載體的支口試管，次日將混合液洗滌收集沉淀加入10 mL去離子水，渦旋震蕩混勻，即得hPDLC/CMC 固定相懸液濕法裝入細(xì)胞膜色譜柱芯柱套中即得hPDLC/CMC 色譜柱，連接至色譜系統(tǒng)中使用。陽性藥物SIM對(duì)hPDLC/CMC進(jìn)行測(cè)試分析并考察其適用性，為了驗(yàn)證hPDLC/CMC 對(duì)其膜表面受體特異性結(jié)合的藥物具有分離保留活性，將0.2 mg/mL SIM溶液5 μL注入色譜系統(tǒng)，比較在相同長(zhǎng)度的純硅膠色譜柱和hPDLSC/CMC色譜柱上的保留特性及活性持續(xù)時(shí)間，并記錄CMC色譜圖。將一根hPDLC/CMC色譜柱充分平衡后，連續(xù)進(jìn)樣 5 μL 0.2 mg/mL 的 SIM 3次，以保留時(shí)間為指標(biāo)來考察色譜柱的內(nèi)差異性，此外按照相同方法制備 3根hPDLC/CMC 色譜柱，同時(shí)將 3根色譜柱置于液相色譜內(nèi)，在相同條件下分別進(jìn)樣 5 μL 0.2 mg/mL SIM，以每根色譜柱上的保留時(shí)間峰面積為指標(biāo)，考察柱間差異性。利用3次富集組分的峰面積得出富集后的平均峰面積來計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值)，要求符合定性實(shí)驗(yàn)RSD<5%。

1.3.3 供試品測(cè)定：將hPDLC/CMC色譜柱連接入液相色譜系統(tǒng)中，根據(jù)2010《藥典》及文獻(xiàn)研究[9]選定的色譜條件：流動(dòng)相(去離子水、5 mmol/L磷酸鹽緩沖液)；柱溫：37.5 ℃；流速：0.2 mL/min。辛伐他汀定容至0.2 mg/mL，檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；三七各提取物定容至1 mg/mL，人參皂苷Rb1、Rg1陽性對(duì)照品定容至0.2 mg/mL，檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm。用流動(dòng)相平衡2～3 h 待基線平穩(wěn)后，吸取供試品溶液5 μL注入色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析測(cè)定，并采用UV檢測(cè)器記錄CMC色譜圖。三七提取物中活性成分的篩選與分析：吸取三七各部位的提取液注入色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析測(cè)定，將能夠在hPDLC/CMC上產(chǎn)生良好保留峰形的三七提取物稱為其活性部位。再吸取三七的主要成分人參皂苷Rb1、Rg1[10]陽性對(duì)照品進(jìn)樣檢測(cè)與保留峰形進(jìn)行比較，對(duì)保留的活性成分進(jìn)行初步鑒定。

1.3.4 數(shù)據(jù)圖形分析：本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的RSD值 =標(biāo)準(zhǔn)差(SD)/計(jì)算結(jié)果的算術(shù)平均值(X)×100%，它是一種量度數(shù)據(jù)分布的分散程度標(biāo)準(zhǔn)，用以衡量數(shù)據(jù)值偏離算術(shù)平均值的程度。標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，這些值偏離平均值就越少，反之亦然。制圖采用Graphad Prism 5.0 和Origin 2019b等制圖軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀色譜圖：辛伐他汀系統(tǒng)在hPDLC/CMC色譜柱具有很好的分離及保留活性，可見hPDLC/CMC 色譜柱在10 min 左右有明顯的保留色譜峰出現(xiàn)，而在純硅膠色譜柱上并無任何保留，說明SIM在hPDLC/CMC 有保留是因?yàn)楣枘z表面包覆的hPDLC 膜受體和SIM之間的特異性結(jié)合作用導(dǎo)致，而純硅膠柱上則沒有這種特異性結(jié)合。色譜柱由于其受體活性存在而對(duì)藥物具有一定的分離活性。色譜柱內(nèi)及柱間RSD值均<5%，見表1。

2.2 三七色譜圖：辛伐他汀色譜圖作為陽性對(duì)照(圖1，目錄后)。三七的主要成分人參皂苷Rb1、Rg1陽性對(duì)照品進(jìn)樣檢測(cè)均產(chǎn)生良好保留峰形(圖2-圖3,目錄后)。三七6個(gè)提取部位均能夠在hPDLC/CMC上產(chǎn)生良好保留峰形。

3 討論

中藥在口腔疾病的研究與治療相對(duì)較少，其在調(diào)節(jié)免疫力，增強(qiáng)牙周組織的防御修復(fù)和再生能力有良好的效果[11]。而牙周炎是多發(fā)且難以治愈的口腔慢性感染性疾病，治療牙周炎可以汲取中醫(yī)藥的精髓，發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，從而對(duì)牙周炎產(chǎn)生較好的防治效果。三七具有止血、散疲、消腫止痛、保護(hù)心肌細(xì)胞、降血脂、抗血栓、增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗纖維化、消除氧自由基等作用[12]。三七總皂昔對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性模型有良好的抗炎作用[13]：它能對(duì)抗組胺，5-羥色胺等致毛細(xì)血管通性增加及炎癥組織前列環(huán)素的釋放，抑制巨噬細(xì)胞受到炎癥刺激和白介素的釋放[14]。而三七在口腔疾病的研究與治療較少，本研究通過牙周細(xì)胞膜色譜聯(lián)用高效液相分析色譜峰，用新的實(shí)驗(yàn)方法與理念發(fā)現(xiàn)三七各部位提取物均能與人牙周細(xì)胞膜親和富集，說明hPDLC/CMC色譜柱對(duì)三七的各個(gè)提取成分具有很好的分離及保留活性，三七藥物內(nèi)的某活性成分能夠與人牙周膜細(xì)胞膜有親和靶點(diǎn)，并能夠在局部作用一定的時(shí)間，從而發(fā)揮它的藥理作用，這為研發(fā)三七新藥物能夠發(fā)揮在牙周局部吸收藥物效能提供了理論支持。但是具體的親和靶點(diǎn)并不確切，依據(jù)文獻(xiàn)得知三七的主要活性成分為人參皂苷Rb1、Rg1等[10]，通過前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果假設(shè)三七的主要活性成分Rb1、Rg1能夠與牙周細(xì)胞膜有靶點(diǎn)，通過檢測(cè)結(jié)果證實(shí)假設(shè)成立，并明確了利用固定相包覆的牙周細(xì)胞膜表面特定活性膜受體與Rb1、Rg1配體之間有“受體-配體”親和作用的靶點(diǎn)，這種特異性結(jié)合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為課題組研究三七活性成分Rb1、Rg1 對(duì)人牙周膜細(xì)胞的作用奠定了基石。但是活性部位在具體哪個(gè)膜受體且如何作用的機(jī)理尚不明確，需要深入的研究。藥物篩選是發(fā)現(xiàn)有效治療人類疾病藥物的基礎(chǔ)，藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證是新藥研發(fā)的第一步，也是藥物篩選及藥物定向合成成敗的關(guān)鍵因素之一[15]。本研究為三七的活性部位治療牙周炎疾病提供了新的理論知識(shí)，為治療口腔疾病新的中藥研發(fā)提供依據(jù)。

由于中藥成分復(fù)雜，目前尚無完整系統(tǒng)的研究明確具體是中藥復(fù)雜體系中的哪個(gè)部位或者成分針對(duì)不同的細(xì)胞或者疾病發(fā)揮藥理作用。本研究結(jié)果說明hPDLC/CMC分析方法作為一種體外二維生物親和色譜方法，能夠快速高效地篩選、分離并鑒定出中藥復(fù)雜成分中與牙周細(xì)胞膜表面有特異性結(jié)合的活性化合物，從而為特異性篩選用于治療疾病的中藥活性化合物提供新的思路和方法。