陳德勝，張 晨，宋國瑞，劉子歌，郭鳳英，李 燕

髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、強制性脊柱炎合并強直髖、股骨頭無菌性壞死等髖部病變是骨科常見關(guān)節(jié)疾患，臨床上通常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、步態(tài)異常，功能障礙等[1-2]。人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療髖關(guān)節(jié)中晚期病變最為理想的治療方法[3]。而無菌性松動導致的假體周圍骨溶解是術(shù)后最嚴重的并發(fā)癥之一[4]。假體部件互相摩擦不斷磨損從而產(chǎn)生磨損顆粒在骨-假體的界膜組織內(nèi)激活巨噬細胞，導致釋放出腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種炎性介質(zhì)和細胞因子，引起無菌性炎性反應(yīng)，誘導破骨細胞增殖、成熟、活化，引起假體周圍骨溶解反應(yīng)[5-6]，使得假體松動、下沉，因而必須行人工關(guān)節(jié)翻修手術(shù)。磨損顆粒如何引起無菌性炎性反應(yīng)，從而出現(xiàn)假體周圍骨溶解是當前有待于研究的熱點。有研究證實[7]，磨損顆?？梢疬m應(yīng)性免疫反應(yīng)，主要由巨噬細胞參與的固有免疫反應(yīng)。適應(yīng)性免疫與固有免疫在磨損顆粒誘導的假體周圍骨溶解過程中有重要的參與作用，與巨噬細胞、破骨細胞、淋巴細胞及其趨化因子調(diào)控的信號通路關(guān)系密切。Toll樣受體(TLR4)與之關(guān)系密切[8]。本文在構(gòu)建鈦顆粒刺激小鼠植骨氣囊誘導骨溶解動物模型時，觀察TLR4抑制劑TAK-242(瑞沙拖維)對于鈦顆粒刺激小鼠植骨氣囊誘導骨溶解的影響，以尋求預防和延緩無菌性松動的方法和手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選用磨損顆粒的鈦顆粒購于美國Alfa Aesar公司，顆粒要求的大小平均直徑小于20 μm。內(nèi)毒素檢測試劑盒購于廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，TLR4選擇性抑制劑TAK-242(瑞沙拖維)購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，TLR4及TNF-α一抗抗體購于美國Sigma公司。

1.2 實驗動物：選用雌性SPF級BALB/c小鼠體重在28～35 g，10～12周齡，健康狀況良好，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心，動物實驗均在寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房完成。動物實驗經(jīng)寧夏醫(yī)科大學實驗動物管理和使用委員會審批通過，符合動物倫理要求。

1.3 實驗方法

1.3.1 磨損顆粒的內(nèi)毒素去除處理和檢測：鈦顆粒置于烘烤燥箱內(nèi)在180 ℃下焙烤6 h，浸泡于70%乙醇，再離心、沉淀，反復多次進行循環(huán)此操作，加PBS液洗滌、離心、干燥，通過紫外線持續(xù)照射消毒，配制成鈦顆粒懸液放置于4 ℃溫度下。鈦顆粒懸液需經(jīng)過內(nèi)毒素檢測，按照內(nèi)毒素檢測試劑盒說明書的程序進行測試后備用。

1.3.2 小鼠air pouch氣囊植骨動物模型建立方法：將小鼠腹腔麻醉成功后，小鼠背部消毒備皮，注射2 mL無菌空氣形成氣囊；之后連續(xù)每天向小鼠背部氣囊中注射0.5 mL無菌空氣，至第7天air pouch氣囊形成；另外隨機選同屬同齡小鼠處死，取出顱骨骨片，分成兩部分，每部分可以做一個植骨供體。切開氣囊，植入小鼠顱骨骨片，縫合切口。

1.3.3 動物模型分組和處理：將60只SPF級BALB/c雌性小鼠隨機分為對照組(A組)、模型組(B組)和TLR4抑制劑組(C組)，每組20只。另選30只SPF級BALB/c同屬同齡雌性小鼠，作為磨損顆粒誘導骨溶解動物模型植骨的供體，每只小鼠可提供兩片用于植骨的顱骨骨片，大小約0.5 cm×0.25 cm×0.1 cm。對照組(A組):植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射0.1 mL PBS液。每日1次腹腔注射0.1 mL生理鹽水，持續(xù)14d。模型組(B組):植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射 0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，每日1次腹腔注射0.1 mL生理鹽水，持續(xù)14 d。TLR4抑制劑組(C組)：植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射 0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，每日1次腹腔注射200 mg/kg TLR4抑制劑 TAK-242，持續(xù)14 d。之后將3組動物在同一時間段處死，取出小鼠顱骨及其囊壁組織(植骨氣囊復合體)。取出的小鼠顱骨及其囊壁組織經(jīng)12.5% EDTA脫鈣液脫鈣，至少需要2周；經(jīng)自動脫水機處理后進行石蠟包埋，制成蠟塊。用切片機切皮，每片4 μm，撈片到載玻片上。

1.3.4 蘇木素-伊紅(H-E)染色：切片先后置入不同濃度的二甲苯、無水乙醇及酒精中浸泡，之后用蒸餾水洗滌；加蘇木素染色，自來水沖洗，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，用0.6%氨水返藍，流水沖洗；置入伊紅染液染色；置入不同濃度酒精、無水乙醇及二甲苯脫水透明；中性樹膠封片。

1.3.5 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：將切片二甲苯脫蠟后，依次經(jīng)過不同濃度乙醇脫水，雙蒸水沖洗；丙酮溶液固定，雙蒸水沖洗；放入暗盒內(nèi)，加入新鮮配制 TRAP 染液，37 ℃水浴鍋避光孵育 1 h；雙蒸水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗，中性樹膠封片。

1.3.6 免疫組織化學染色：切片在68 ℃中烤2 h 后入不同濃度二甲苯、無水乙醇浸泡，自來水、蒸餾水沖洗；3% H2O2孵育，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液煮沸予抗原修復，滴加羊血清于玻片封閉，PBS液沖洗，滴加一抗(TLR4，TNF-α)孵育，4 ℃ 過夜，PBS沖洗，滴加酶標二抗，37 ℃ 孵育，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉抗生物素蛋白稀釋液，37 ℃ 孵育，滴加DAB液靜置數(shù)分鐘，置于顯微鏡下觀察顯色，適時終止，沖洗，蘇木素液復染，1%鹽酸酒精分化，碳酸鋰返藍，不同濃度的乙醇、二甲苯浸泡，中性樹脂封片。3組免疫組化染色切片通過顯微鏡下觀察結(jié)果并進行圖像采集，每張免疫組化切片隨機選取5個表達的高倍鏡(10×40)視野，需確保每張圖像的位置以及背景亮度一致。將采集圖像運用Image-Pro軟件進行分析，確定統(tǒng)一的測定標準，計算分析后得到平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 蘇木素-伊紅(H-E)染色：H-E染色結(jié)果，對照組中未見鈦顆粒浸潤，植骨氣囊復合體周圍組織見少量的中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞等，炎癥反應(yīng)不明顯，植骨塊骨面平滑且光整；模型組植骨氣囊復合體的囊壁增厚，周圍鈦顆粒浸潤，有中性粒細胞、巨噬細胞及嗜酸性粒細胞等浸潤，炎性反應(yīng)顯著，植骨塊表面存在侵蝕，骨面不光整，部分有缺損表現(xiàn)。TLR4抑制劑組亦有鈦顆粒浸潤，植骨氣囊復合體周圍氣囊組織厚度與模型組比相對較薄，周圍有少量炎性細胞，植骨骨塊表面侵蝕反應(yīng)減輕，比較平整。

2.2 抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)：對照組見少量的TRAP染色陽性細胞，染色較淺，陽性染色面積??；模型組TRAP染色陽性細胞數(shù)目比較多，陽性染色面較大，而且染色深；TLR4抑制劑組TRAP染色陽性細胞數(shù)目與模型組比較少(圖1,目錄后)。TRAP染色陽性細胞數(shù)目統(tǒng)計，模型組TRAP染色陽性細胞數(shù)目(18.105±1.641)個顯著高于對照組(8.278±0.9515)個(P<0.05)，而TLR4抑制劑組TRAP染色陽性細胞數(shù)目(13.102±1.532)個相對于模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組TRAP染色陽性細胞數(shù)目比較

2.3 小鼠氣囊組織中TLR4免疫組織化學染色：對照組植骨氣囊復合體周圍囊壁組織中可見TLR4染色陽性細胞，陽性染色相對較淺；模型組植骨氣囊復合體周圍囊壁組織中可TLR4染色陽性細胞數(shù)目多，陽性表達比較高；而TLR4抑制劑組中TLR4染色陽性細胞數(shù)目及陽性表達與模型組相比而言都減少(圖2，目錄后)。模型組TLR4陽性表達(0.113±0.010)顯著高于對照組(0.042±0.012)(P<0.05)，而TLR4抑制劑組TLR4陽性表達(0.069±0.012)相對于模型組(P<0.05)顯著減少，見表2。

表2 3組TLR4免疫組化表達比較

2.4 小鼠氣囊組織中TNF-α免疫組織化學染色：對照組中可見少量的TNF-α染色陽性細胞，陽性染色較淺；而模型組TNF-α染色陽性細胞數(shù)目顯著增多，陽性表達較高；TLR4抑制劑組中TNF-α染色陽性細胞數(shù)目及陽性表達均較少(圖3-圖4，目錄后)。

3組免疫組化結(jié)果運用Image-Pro軟件進行分析后，統(tǒng)計結(jié)果如下，模型組TNF-α陽性表達(0.131±0.204)顯著高于對照組(0.033±0.112)(P<0.05)，而TLR4抑制劑組TNF-α陽性表達(0.080±0.085)相對于模型組(P<0.05)顯著減少，見表3。

表3 3組TNF-α免疫組化表達比較

3 討論

假體周圍骨溶解導致的無菌性松動是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最為嚴重的并發(fā)癥之一，也是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動、下沉、失敗最主要的影響因素。因此，患者常需要經(jīng)歷多次反復人工關(guān)節(jié)翻修手術(shù)，給患者個人造成嚴重的痛苦，也給社會帶來極大的經(jīng)濟負擔[9]。目前研究表明[5]，磨損顆粒刺激人工關(guān)節(jié)的界膜組織巨噬細胞、破骨細胞、淋巴細胞等會引起一系列無菌性炎性反應(yīng)的生物學改變，激活破骨細胞，出現(xiàn)假體周圍骨溶解的人工關(guān)節(jié)無菌性松動。

參與上述病理改變的破骨細胞分化、增值、成熟由多個信號通路如 NF-κB、ERK、JNK、p38MAPK、PI3K/AKT 等參與，通過單一或者協(xié)同作用來調(diào)控破骨細胞骨溶解作用。而Toll樣受體(TLR)或其他模式識別受體信號通路可以介導活化的NF-κB、ERK、JNK、p38MAPK信號通路而調(diào)控無菌性炎性反應(yīng)[10]。

TLR是一種最早被提出能識別細菌和其他病原體分子相關(guān)的一種模式識別受體(PRR)，被用來識別病原相關(guān)分子模式(PAMP)以及損傷相關(guān)分子模式(DAMP)，在宿主防御入侵的病原體過程中有關(guān)鍵性作用[11]。TLR是所有PRR中最具特征的代表。TLR屬于I型跨膜糖蛋白(type I transmembrance protein)，能識別病原微生物進化中保守分子，如脂多糖、肽聚糖、病原微生物等的核酸。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)有TLR1～10，10個TLR受體。TLR2和TLR4的配體能識別大部分革蘭氏菌相關(guān)的配體，包含了絕大多數(shù)對人體致病的微生物類別，在人體TLR家族中最為重要[12]。TLR4 是第一個被識別的Toll樣受體，可以特異性識別并結(jié)合革蘭陰性菌細胞壁的脂多糖，從而激活核因子κB(NF-κB)，進一步促進TNF-α、IL-6 等炎性因子的激活，引起一系列內(nèi)源性免疫反應(yīng)，最終導致組織器官損傷。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后各關(guān)節(jié)部件之間摩擦產(chǎn)生的磨損微粒能夠通過髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴途徑激活巨噬細胞表面的TLR，啟動活化的NF-κB信號通路等從而釋放各種促炎因子，激活破骨細胞分化成熟，從而造成骨代謝的失衡，導致骨溶解的形成[13-14]。TLR在人工關(guān)節(jié)無菌性松動的發(fā)病過程中有著極其重要的作用。此外，TNF-α是機體介導炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵炎性介質(zhì)，當磨損顆粒刺激巨噬細胞后，TNF-α協(xié)同巨噬細胞釋放多種炎性介質(zhì)和細胞因子的產(chǎn)生及釋放，發(fā)揮“級聯(lián)放大”的作用，在整個炎癥反應(yīng)中，TNF-α有著重要的始動作用[15]。此外，作為炎癥反應(yīng)相關(guān)的細胞因子，TNF-α也能激活TLR2和TLR4，并進一步促進釋放多種炎性因子[16]。

本實驗是在小鼠磨損顆粒誘導骨溶解模型基礎(chǔ)上，選用TLR4抑制劑TAK-242作用于該動物模型。病理學觀察結(jié)果顯示，TLR4抑制劑TAK-242可以減輕鈦顆粒刺激小鼠入air pouch植骨氣囊中炎性反應(yīng)；TRAP染色結(jié)果也證實，TLR4抑制劑TAK-242可以減少鈦顆粒刺激后破骨樣細胞的陽性細胞數(shù)目及陽性表達范圍。這些組織形態(tài)學改變表明：通過下調(diào)TLR信號通路，磨損顆粒誘導骨溶解模型中的炎性因子數(shù)目減少，炎性反應(yīng)在一定程度上得到了減輕。在免疫組化中TLR4抑制劑TAK-242作用下植骨氣囊復合體中TLR4和TNF-α的陽性表達明顯降低，說明下調(diào)TLR信號通路，可使活化的NF-κB信號通路等作用降低，也進一步減少了促炎性因子的釋放，影響了破骨細胞分化成熟，使得骨溶解的作用減弱。與此同時，經(jīng)下調(diào)TLR信號通路，TNF-α協(xié)同巨噬細胞釋放多種炎性介質(zhì)和細胞因子的產(chǎn)生及釋放的作用也受到抑制，同時TNF-α對TLR2和TLR4激活作用減弱，釋放多種炎性因子作用也相應(yīng)減弱。

綜上所述，TLR信號轉(zhuǎn)導通路在無菌性炎性骨溶解中發(fā)揮了重要作用。通過對TLR信號轉(zhuǎn)導通路的MyD88依賴途徑的調(diào)控，可能對NF-κB信號通路等激活作用減弱，阻止了炎性因子釋放，抑制破骨細胞分化成熟，從而延緩炎性骨溶解發(fā)生、發(fā)展。