楊思琪，趙海霞，尤 旭，馬瓊艷，楊 圓，張 艷，葉 勇，吳 杰，袁 丁，張長城

(三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002)

近年來，不育已被WHO確認為一個公共衛(wèi)生問題，在普通人群中的發(fā)病率逐年增高。一項調(diào)查研究顯示，全世界約有15%的成年夫婦患有原發(fā)性不育癥，其中由男性因素導致的不育約占50%，而其具體成因機制尚不十分清楚[1]。研究發(fā)現(xiàn)，精原細胞損傷所致男性生精功能障礙是導致男性不育的主要原因[2]。另有研究顯示，DNA損傷是導致精原細胞功能受損的主要原因之一[3-4]。近年來發(fā)現(xiàn)射線、活性氧(ROS)、化療藥物等都會導致睪丸生精細胞DNA損傷，從而導致睪丸功能障礙，但其研究主要聚焦在動物水平上，在細胞水平上研究甚少，且目前仍缺乏較好的細胞模型。因此，本研究以小鼠睪丸精原細胞株GC-1細胞為研究對象，采用UVB輻照、D-半乳糖(D-galactose，D-Gal)、博來霉素(bleomycin，BLM)刺激建立3種GC-1細胞DNA損傷模型并進行比較和評價，以期為防治因DNA損傷所致男性不育提供相應的實驗模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1細胞株 小鼠精原細胞株GC-1細胞購自上海通派生物細胞庫。

1.1.2藥物及試劑 D-Gal購于美國Sigma公司，批號：WXBC9497V；BLM購于瀚暉制藥有限公司，批號：19012311；ECL顯影液購自碧云天生物技術(shù)研究所；苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfluoride，PMSF)、RIPA裂解液、磷酸蛋白酶抑制劑購自武漢谷歌生物有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；β-actin(批號：#4970L)、p-p53(批號：#12571)購自美國Cell Signaling Technology公司；γ-H2AX(批號：sc-101696)購自Santa Cruz公司；p21(批號：ab109199)購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶 (Horseradish Peroxidase，HRP)標記的山羊抗鼠 IgG、HRP標記的山羊抗兔二抗購自武漢科瑞科技有限公司。

1.1.3主要儀器 CKX41型光學倒置顯微鏡，日本Olympus公司；FORMA series Ⅱ二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；SW-4T-2F型超凈工作臺，上海博訊實業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠；TD25-WS型臺式低速離心機，湖南省湘儀儀器有限公司；Centrifuge 5424 R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Power Pac TM Basic電泳儀，美國Bio-Rad公司；Bioshine Chemic Q 4800化學發(fā)光凝膠成像自動顯影儀，上海勤翔科學儀器有限公司；A1R+激光共聚焦顯微鏡，日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1UVB輻照致GC-1細胞DNA損傷模型 將GC-1細胞接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細胞密度達80%左右時，使用40 J·m-2輻照劑量輻照細胞，隨后加入新配置的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞0.5、1、2、4和6 h。

1.2.2D-Gal刺激致GC-1細胞DNA損傷模型 前期預實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用不同濃度(0、50、100、150、200和250 mmol·L-1)D-Gal刺激GC-1細胞不同時間后，DNA損傷修復相關(guān)蛋白表達均在150 mmol·L-1濃度達高峰，因此我們選擇150 mmol·L-1D-Gal濃度刺激GC-1細胞0、1、3、6、12、24h來進一步建立DNA損傷模型。

1.2.3BLM刺激致GC-1細胞DNA損傷模型 不同濃度(2.5、5、10、25和50 mg·L-1)BLM刺激GC-1細胞0.5、1、2、4和6 h后收集細胞。

1.2.4Western blot法檢測GC-1細胞DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2AX、p-p53和p21表達水平 收集上述不同處理組細胞，提取總蛋白，定量，蛋白水浴變性，將蛋白樣品進行電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入兔抗γ-H2AX抗體(1 ∶1 000)、兔抗P-P53抗體(1 ∶2 000)、兔抗P21抗體(1 ∶1 000)和兔抗 β-actin 抗體(1 ∶5 000)，4 ℃冰箱搖床孵育過夜；次日，TBST洗膜，加HRP標記的山羊抗兔二抗(1 ∶3 000)，室溫孵育1 h；TBST洗膜。ECL化學發(fā)光于凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像。

1.2.5免疫熒光法檢測GC-1細胞γ-H2AX和8-OHdG蛋白表達及定位 將無菌圓形蓋玻片放入24孔板中，將GC-1細胞懸液接種到無菌玻片上，按照“1.2.1”、“1.2.2”、“1.2.3”項下處理細胞后棄掉上清，PBS洗滌細胞20 min后，4%多聚甲醛固定細胞30 min后PBS洗滌20 min。后經(jīng)0.1% Triton X-100打孔15 min，PBS洗滌細胞20 min。1% BSA于溫度為25 ℃下封閉1 h，棄掉封閉液后，置于4 ℃冰箱孵育一抗。一抗孵育完成后，25 ℃復溫30 min以上，PBS洗滌細胞20 min。37 ℃下避光孵育熒光二抗1 h，PBS洗滌細胞后，避光孵育DAPI(0.5 mg·L-1)5 min，PBS洗滌后封片，共聚焦顯微鏡下觀察并拍照取圖。

2 結(jié)果

2.1 不同處理因素對GC-1細胞γ-H2AX蛋白表達和定位的影響

Fig 1 Effect of 40 J/m2UVB irradiation on expression of γ-H2AX protein in GC-1 n=3)

Fig 2 Effect of 150 mmol·L-1 D-Gal treatment on expression of γ-H2AX protein in GC-1 n=3)

Fig 3 Effects of different concentrations of BLM on expression of γ-H2AX protein in GC-1 cells

Fig 4 Effects of different treatment factors on expression and localization of γ-H2AX protein in GC-1 cells (× 400)

2.1.1不同處理因素對GC-1細胞γ-H2AX蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，UVB輻照后，γ-H2AX蛋白表達水平在4 h達到高峰，隨后開始下降；D-Gal處理GC-1細胞不同時間后，γ-H2AX蛋白表達水平在6 h達到高峰，隨后開始明顯下降；不同濃度BLM刺激GC-1細胞不同時間后，當BLM濃度在2.5～10 mg·L-1范圍時，γ-H2AX蛋白表達水平逐漸升高，提示DNA損傷不斷加重，當BLM濃度在25～50 mg·L-1范圍時，γ-H2AX蛋白表達水平在2 h達到峰值，4 h開始下降，提示此時GC-1細胞損傷嚴重，細胞可能開始凋亡。

2.1.2不同處理因素對GC-1細胞γ-H2AX蛋白表達和定位的影響 為進一步觀察不同處理因素對GC-1細胞DNA損傷的影響，我們采用免疫熒光法觀察GC-1細胞γ-H2AX表達和定位。UVB輻照后，γ-H2AX熒光強度在4 h最強，隨后減弱；150 mmol·L-1D-Gal處理GC-1細胞后，γ-H2AX熒光強度在6 h最強，隨后開始減弱，24 h后熒光強度已接近正常水平；10 mg·L-1BLM刺激GC-1細胞不同時間后，γ-H2AX熒光強度持續(xù)增強。免疫熒光結(jié)果均與Western blot結(jié)果一致。

Fig 5 Effects of different treatment factors onexpression and localization of 8-OHdG in GC-1 cells (× 400)

2.2 不同處理因素對GC-1細胞8-OHdG表達和定位的影響免疫熒光結(jié)果顯示，在未處理的GC-1細胞中未檢測到熒光，UVB輻照和BLM刺激后，8-OHdG在胞核和胞質(zhì)內(nèi)均有表達，且隨著處理時間延長，GC-1細胞核內(nèi)表達逐漸增多，提示GC-1細胞氧化性DNA損傷不斷加重，DNA修復酶來不及切割8-OHdG，導致愈來愈多的8-OHdG蓄積在細胞核內(nèi)；D-Gal處理后，8-OHdG主要表達在胞質(zhì)，在6 h達到高峰，隨后開始下降。

Fig 6 Effect of UVB irradiation on expression of p-p53 and p21 protein in GC-1 n=3)

Fig 7 Effect of 150 mmol·L-1 D-Gal treatment on expression of p-p53 and p21 protein in GC-1 n=3)

2.3 不同處理條件對GC-1細胞p-p53和p21蛋白表達的影響Western blot結(jié)果顯示，UVB輻照后，p-p53和p21蛋白表達水平逐漸升高，p-p53蛋白表達水平2 h后開始明顯升高，p21在6 h開始明顯升高；150 mmol·L-1D-Gal處理GC-1細胞不同時間后，p-p53蛋白表達水平在6 h達到高峰，p21蛋白表達水平在6 h開始明顯增加，12 h達到高峰，24 h后p-p53和p21蛋白表達水平均下降；濃度為2.5、5、10 mg·L-1的BLM處理GC-1細胞不同時間后，p-p53和p21蛋白表達水平均逐漸升高，且趨勢一致，而25和50mg·L-1濃度的BLM處理GC-1細胞不同時間后，p-p53和p21蛋白表達水平均在2 h達到峰值，4 h后p-p53表達量開始下降，p21蛋白幾乎無表達。

Fig 8 Effects of different concentrations of BLM on expression of p-p53 and p21 protein in GC-1 cells

3 討論

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，不育癥可由多種因素引起，如DNA損傷、職業(yè)和環(huán)境、遺傳、下丘腦-垂體功能紊亂等[5-6]。射線、ROS、化療藥等都會導致睪丸生精細胞DNA損傷，從而導致睪丸功能障礙，降低男性生育力。紫外線輻照是最重要的DNA損害劑之一，特別是UVA和UVB，不僅可以被DNA直接吸收導致?lián)p傷，而且還可以被皮膚細胞中存在的生色團吸收。這一過程可導致ROS形成，從而間接造成DNA損傷[7]。D-Gal是一種生理性營養(yǎng)成分，在正常機體代謝中可轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，參與葡萄糖代謝，但過量的D-Gal可導致細胞內(nèi)代謝紊亂，使組織和細胞中氧化酶活性改變，產(chǎn)生一些氧化產(chǎn)物如ROS，導致生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的氧化損傷[8]。BLM是一種具有抗癌和其他臨床應用的氧化還原活性藥物，主要用于治療睪丸癌、陰莖鱗癌等，也經(jīng)常用作工具藥，其作用機制主要是直接嵌入DNA的G-C堿基對中，還可以與DNA磷酸基相互作用，使其解鏈，而后導致氧自由基和羥自由基生成，引起DNA鏈斷裂[9]。因UVB、D-Gal和BLM 3種因素導致DNA損傷的作用機理不同，其導致細胞DNA損傷的表現(xiàn)，損傷后修復的機制是否有差異尚有待探究。

研究發(fā)現(xiàn)，當細胞發(fā)生DNA損傷時，組蛋白H2AX Ser139位點被磷酸化為γ-H2AX并募集到損傷處，在細胞核中形成焦點，是DNA雙鏈斷裂早期的一個關(guān)鍵標記物[10-11]。因此，我們采用Western blot和免疫熒光法檢測3種處理方式對GC-1細胞γ-H2AX蛋白表達和定位的影響。Western blot結(jié)果顯示，UVB輻照后，GC-1細胞γ-H2AX蛋白表達在4 h達到高峰，D-Gal處理后GC-1細胞γ-H2AX蛋白表達在6 h達高峰，與免疫熒光結(jié)果一致。不同濃度BLM處理后γ-H2AX蛋白表達隨時間延長持續(xù)升高，且BLM濃度越高，γ-H2AX蛋白表達達到高峰時間越短。隨后，我們選取10 μg·L-1BLM不同時間刺激GC-1細胞，免疫熒光法檢測γ-H2AX表達和定位，結(jié)果顯示，10 mg·L-1BLM刺激后γ-H2AX表達持續(xù)上升，與Western blot結(jié)果一致。以上結(jié)果提示，3種處理方式對GC-1細胞DNA損傷程度不同，D-Gal處理后，GC-1細胞DNA損傷達到高峰的時間最長，提示DNA損傷較輕，而UVB輻照和BLM刺激后GC-1細胞DNA損傷較重。

當細胞DNA鳥嘌呤堿基受到ROS的攻擊，其第8位碳原子會額外增加1個羥基，從而直接形成1個經(jīng)過氧化修飾的產(chǎn)物8-OHdG，而后8-OHdG會被DNA修復系統(tǒng)中的糖基化酶識別并切除，之后被運出胞外，此，8-OHdG被認為是氧化性DNA損傷的標記物之一[12]。本實驗采用免疫熒光法觀察3種不同處理因素對GC-1細胞8-OHdG表達和定位的影響。結(jié)果顯示，在未處理的GC-1細胞中未檢測到熒光，UVB輻照和BLM刺激后，8-OHdG在胞核和胞漿內(nèi)均有表達，且隨著處理時間延長，核內(nèi)表達逐漸增多，可能是GC-1細胞DNA損傷不斷加重，DNA修復酶來不及切割8-OHdG，導致大量8-OHdG被蓄積在細胞核內(nèi)；而D-Gal處理后，8-OHdG主要表達在胞質(zhì)，在6 h達到高峰，隨后開始下降，提示DNA氧化損傷開始減輕，DNA損傷修復啟動。以上結(jié)果表明，相比于D-Gal處理組，UVB輻照和BLM處理組GC-1細胞DNA氧化損傷較重。

DNA損傷后，可激活細胞內(nèi)DNA損傷應答反應，招募一系列損傷應答蛋白到損傷位點，介導細胞周期阻滯進而修復損傷的DNA或誘導凋亡清除無法修復的細胞，維持基因組穩(wěn)定性[13]。當細胞發(fā)生DNA損傷時可激活p53，在DNA損傷較輕時活化的p53可以激活p21，引起細胞周期停滯，避免受損的DNA進行復制后在細胞內(nèi)累積，而在DNA損傷較重時，活化的p53可直接誘導細胞凋亡[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，阿霉素可導致糖尿病性β細胞DNA損傷，γ-H2AX、53BP1及p21蛋白表達水平明顯增加，而給予p21抑制劑后，細胞凋亡率明顯增加。本研究結(jié)果顯示，UVB輻照后，GC-1細胞p-p53蛋白表達水平2 h后開始上升，6 h后p21蛋白表達水平開始明顯上升。其原因可能是UVB輻照GC-1細胞后細胞周期阻滯較滯后，而具體機制尚有待探究。D-Gal處理GC-1細胞不同時間后，p-p53蛋白表達水平在6 h達到高峰，p21蛋白表達水平在12 h達到高峰，24 h后p-p53、p21和γ-H2AX蛋白表達水平均接近正常對照組，此時8-OHdG表達量也相對較低，提示部分損傷的GC-1細胞可能已經(jīng)被修復，而損傷較重的細胞則可能發(fā)生了凋亡。2.5、5、10 mg·L-1BLM處理GC-1細胞不同時間后，p-p53和p21蛋白表達水平均在2 h開始上升，趨勢保持一致，其原因可能是BLM處理后，損傷細胞較多，p-p53直接激活p21，使細胞周期阻滯，為DNA損傷修復爭取時間。25、50 mg·L-1BLM處理GC-1細胞不同時間后，p-p53和p21蛋白表達水平在2 h達到高峰，4 h后p-p53表達量開始下降，p21蛋白幾乎無表達，其原因可能是高濃度BLM處理GC-1細胞4 h后，細胞DNA損傷較為嚴重而導致無法修復，p-p53直接誘導了細胞凋亡。

綜上所述，因3種處理方式導致GC-1細胞DNA損傷機理不同，對GC-1細胞DNA損傷的程度也就存在差異，UVB輻照和BLM處理對GC-1細胞DNA損傷更重。此外，DNA損傷修復的機制亦存在一定的差異，UVB輻照和D-Gal處理后，GC-1細胞周期阻滯較滯后，而BLM處理后，GC-1細胞DNA損傷修復與周期阻滯同步進行。因此，在后續(xù)實驗中，研究者可根據(jù)不同的實驗目的來選擇不同的DNA損傷模型。本研究旨在為后續(xù)在細胞水平上研究DNA損傷所致的男性不育及其分子機制奠定一定的實驗基礎(chǔ)，為后期研究男性不育的防治提供一定的實驗依據(jù)。