于 丹，付明磊，王 娟，秦建莉，皇甫夢杰，陳 旭

(桂林醫(yī)學(xué)院 1. 藥學(xué)院，廣西 桂林 541100；2. 第二附屬醫(yī)院藥劑科，廣西 桂林 541199)

卵巢癌是婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康。早期卵巢癥狀不明顯，60%的患者一經(jīng)診斷就處于晚期，且其5年生存率約為40%[1-2]。晚期卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療策略是鉑和紫杉醇聯(lián)合化療[3]，盡管化療可以增加卵巢癌病人的生存期，但毒副作用大且易出現(xiàn)耐藥，因此，急需尋找療效好毒性低的抗卵巢癌藥物。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG) 是茶葉的有效活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血壓、降血脂及降血糖等藥理作用[4-5]。因EGCG毒副作用小，其抗腫瘤活性引起許多研究者的關(guān)注，已有研究證實(shí)EGCG對(duì)肝癌、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌及大腸癌等多種腫瘤有一定的抑制作用[6]。目前針對(duì)EGCG的抗卵巢癌研究主要集中在體外，體內(nèi)研究報(bào)道較少，而且也未見有關(guān)其對(duì)血管生成因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)影響的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬觀察EGCG對(duì)卵巢癌 SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用，以卵巢癌一線藥物紫杉醇為陽性對(duì)照，比較EGCG體內(nèi)抗卵巢癌的效果；觀察EGCG干預(yù)后移植瘤中VEGF、PCNA 的表達(dá)，探討其抗卵巢癌的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞及動(dòng)物 卵巢癌SKOV3細(xì)胞為本課題組傳代保存。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)♀ 6～8周齡BALB/c 裸鼠，體質(zhì)量(15±2)g，購買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0001。

1.1.2藥物和試劑 EGCG購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購自Gemini公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，PBS購自索萊寶，PIPA蛋白裂解液購自碧云天公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自promega公司，SYBR試劑盒購自康為公司，PCNA與VEGF兔多抗購自萬類生物公司，β-actin購自中杉金橋公司，鼠二抗、兔二抗購自北京依瑪博科技有限公司，ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑購自Thermo公司。

1.1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司)；生物安全柜(新加坡ESCO公司)，超低溫冰箱(日本松下公司)，電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、熒光定量PCR儀及化學(xué)發(fā)光儀(美國BIO-RAD公司)，低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1移植瘤模型建立及干預(yù) 體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，待培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，消化收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)制成細(xì)胞懸液(5×107個(gè)·L-1)，每只裸鼠右側(cè)前肢肩背部皮下接種0.2 mL細(xì)胞懸液。待移植瘤長至4 ～ 5 mm時(shí)將裸鼠隨機(jī)分成5組，每組7只。陰性對(duì)照組每天腹腔注射生理鹽水，EGCG(10、 30、 50 mg·kg-1)每天進(jìn)行腹腔注射，紫杉醇(5 mg·kg-1)每3 d進(jìn)行腹腔注射，給藥劑量均為0.2 mL/只。給藥期間觀察裸鼠的生長情況，每2 d記錄移植瘤的長徑和短徑，稱量裸鼠體重。給藥3周后處死裸鼠，取出皮下移植瘤，瘤塊稱重后過液氮，并保存于-80 ℃冰箱。依據(jù)腫瘤的長短徑繪制腫瘤生長曲線，計(jì)算抑瘤率。

1.2.2HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)的變化 取陰性對(duì)照組、紫杉醇組和EGCG高劑量組的裸鼠肝組織經(jīng)多聚甲醛固定后，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察上述各組肝組織形態(tài)學(xué)的變化。

1.2.3RT-qPCR分析VEGF和PCNA基因的表達(dá) 將液氮保存的瘤組織研磨后，按照TRIzol RNA提取方法提取總組織RNA，將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA稀釋5倍備用,采用SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 反應(yīng)體系10 μL，引物由Invitrogen上海公司合成，內(nèi)參為Actin。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見Tab 1。

Tab 1 PCR primer sequence

1.2.4Western blot檢測VEGF和PCNA蛋白的表達(dá) 將液氮保存的瘤組織研磨后，加入蛋白裂解液，離心后取蛋白上清。以每組30 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將樣品蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，麗春紅觀察轉(zhuǎn)膜效果，脫脂牛奶室溫封閉NC膜2 h，分別加入VEGF、PCNA和Actin的一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次后孵育相應(yīng)的二抗(濃度1 ∶4 000-1 ∶8 000)1 h。ECL發(fā)光，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)獲取條帶，并進(jìn)行灰度值分析和計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 EGCG抑制移植瘤的生長隨著EGCG濃度的增加，裸鼠移植瘤的體積增長速度減慢。干預(yù)d 21后，移植瘤的體積分別為：陰性對(duì)照組(858.2±97.4) mm3，紫杉醇組(462±41) mm3，EGCG：(10 mg·kg-1) (738.5±115.3) mm3，(30 mg·kg-1) (542±73) mm3，(50 mg·kg-1) (306±64) mm3。提示EGCG可明顯地抑制裸鼠移植瘤的生長，并且其抑制作用和濃度有關(guān)(Fig 1)。

Fig 1 Growth of ovarian cancer SKOV3 cell xenograft tumor inhibited by EGCG

2.2 裸鼠移植瘤瘤質(zhì)量和抑瘤率的比較給藥21 d后，處死裸鼠，剝?nèi)∫浦擦?，與陰性對(duì)照組相比，EGCG中、高劑量組瘤質(zhì)量(g)明顯減小(P<0.01)，且隨著EGCG濃度(mg·kg-1)的增高，抑瘤率(%)逐漸增加，且呈劑量依賴性。EGCG高劑量組抑瘤率(71.08 %)大于紫杉醇組(48.19 %)(P<0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Tumor weight and anti-tumor rate n=7)

2.3 EGCG作用于裸鼠移植瘤后VEGF及PCNA mRNA的表達(dá)變化給藥不同濃度的EGCG，發(fā)現(xiàn)VEGF和PCNA隨著給藥濃度越高，表達(dá)越低。并且NC組與EGCG中、高劑量組相比差異有顯著性(P<0.05)。PCNA的表達(dá)EGCG各組均高于NC組，差異有著性(P<0.05)。見Tab 3。

Tab 3 Expressions of VEGF and PCNA mRNA in xenografts of nude n=3)

2.4 EGCG作用于裸鼠移植瘤后VEGF及PCNA的蛋白表達(dá)變化如Fig 2蛋白印跡結(jié)果顯示，與NC組相比，EGCG組移植瘤組織中VEGF和PCNA蛋白表達(dá)明顯下降，隨著給藥組濃度增加，差異越明顯，高劑量組與陰性組相比差異有顯著性(P<0.01)。見Tab 4。

Fig 2 Effect of EGCG on VEGF and PCNA of ovarian cancer SKOV3 cell xenograft tumor 1-4 NC，EGCG(10, 30, 50 mg·kg-1)

Tab 4 Protein expressions of VEGF and PCNA in tumor xenografts of nude mice n=3)

2.5 EGCG對(duì)裸鼠體重和肝臟的影響給藥期間，裸鼠體重?zé)o明顯下降，表明裸鼠對(duì)EGCG耐受良好，見Fig 3。肝切片顯示陰性對(duì)照組肝組織完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍放射狀排列，細(xì)胞核染色深而大，細(xì)胞間無明顯間隙，細(xì)胞質(zhì)成分區(qū)分明顯。與陰性對(duì)照組相比，EGCG高劑量組裸鼠肝組織無明顯變化，而紫杉醇組肝細(xì)胞之前間隙明顯，細(xì)胞核固縮。見Fig 4。

3 討論

卵巢癌作為女性常見的生殖器官惡性腫瘤之一，發(fā)病率與死亡率較高[7]。近十年來，卵巢癌的治療方法和藥物不斷發(fā)展，但總體發(fā)展緩慢，卵巢癌的死亡率仍在增加，所以探索新的治療藥物對(duì)于治療卵巢癌至關(guān)重要。本研究通過建立卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，在體內(nèi)水平來探討EGCG對(duì)卵巢癌生長的抑制作用。移植瘤體積大小和抑瘤率可以直觀的反映藥物的抑瘤效果，本研究結(jié)果表明，裸鼠對(duì)EGCG的耐受良好，同時(shí)EGCG對(duì)裸鼠的肝臟無明顯毒性。紫杉醇是從短葉紅豆杉樹皮中提取出的紫杉烷類抗癌藥物，對(duì)卵巢癌抑制作用較為明顯[8]，鉑類聯(lián)合紫杉醇化療是治療卵巢癌的一線化療方案；我們的研究結(jié)果顯示，EGCG高劑量組(50 mg·kg-1)對(duì)卵巢癌移植瘤生長抑制作用優(yōu)于紫杉醇(5 mg·kg-1)，且其對(duì)裸鼠肝臟的影響比紫杉醇小，揭示EGCG可能是卵巢癌治療的潛在藥物。

Fig 3 Effect of EGCG on weight of ovarian cancer SKOV3 cell xenograft tumor

Fig 4 HE staining of nude mouse livers (×100)

VEGF是一種重要的血管生成因子，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新血管形成；它是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)血管產(chǎn)生影響最大的內(nèi)皮生長因子，能增加腫瘤血管生長，加快腫瘤生長發(fā)展[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF在結(jié)腸癌、肝癌、肺腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮了重要作用[10-12]；VEGF在卵巢惡性病變晚期水平升高, 抑制其表達(dá)水平能抑制卵巢腫瘤的惡性發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG劑量增加，移植瘤組織中VEGF表達(dá)逐漸減少。此外，我們還發(fā)現(xiàn)EGCG也能抑制卵巢癌移植瘤組織中PCNA的表達(dá)。PCNA是近年來被用來作為惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要標(biāo)志物，在乳腺癌、胃癌、大腸癌、肺癌、卵巢癌等惡性腫瘤均異常表達(dá)。并且有研究表明抑制PCNA的表達(dá)能抑制卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[13]。因此，EGCG抑制卵巢癌生長可能與其下調(diào)VEGF和PCNA的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，EGCG可以明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，其機(jī)制可能與VEGF及PCNA的表達(dá)下調(diào)有關(guān)，且EGCG毒副作用小，因此EGCG有望成為治療卵巢癌高效低毒的候選藥物。