李光偉，李 波，金 莉，邱麗萍，張亞珍，吳淑琴

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1. 病理生理學(xué)教研室、2.機能實驗教學(xué)中心、3.病理學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是危害人類健康的常見的慢性代謝性疾病，發(fā)病率逐年提高，我國是DM患者最多的國家之一，DM血管病變是其致死致殘的主要原因[1-2]。DM血管病變的重要特點是動脈粥樣硬化，動脈平滑肌細胞增生和遷移是其發(fā)生的原因之一。DM血管病變以及血管平滑肌功能紊亂是多因子參與的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程[3]。研究表明[4]，鈣離子和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在動脈中膜平滑肌細胞表型改變以及增生、遷移過程中發(fā)揮重要作用。

鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在細胞分泌、增殖、分化、趨化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[5]。近年來，越來越多的研究顯示，心血管系統(tǒng)中有CaSR的全長表達，并在血管收縮與動脈粥樣硬化等生理及病理過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[6]。但是CaSR在糖尿病腎動脈硬化中的作用尚無報道。根據(jù)文獻調(diào)研與前期預(yù)實驗情況，我們推測：CaSR可能參與糖尿病腎動脈平滑肌細胞(renal artery smooth muscle cell，RAMSC)增生及遷移的發(fā)展過程。為證明此假說，我們做如下研究，以期為糖尿病腎動脈硬化的臨床治療提供新的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，♂，SPF級。由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物許可證號：SYXK(黑)2008004。

1.1.2主要試劑 CaSR抗體(sc-47741，Santa)；PCNA抗體(sc-25280，Santa)；MMP-2抗體(sc-13595，Santa)；α-SMA抗體(BM0002，博士德)；NPS2143(sc-361280A，Santa)；GdCl3(sc-224004，Santa)；胰島素(CI6561，coolader)；細胞周期試劑盒(G019，南京建成)；MMP-2 ELISA檢測試劑盒(H146-1，南京建成)；Transwell小室(3422，corning)；DAB顯色試劑盒(AR1022，博士德)；即用型SABC試劑盒(SA1025，博士德)。

1.1.3主要儀器 倒置顯微鏡(Olympus)；DF-D 型恒壓恒流電泳儀(北京六一廠) ；高速離心機(Sigma)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能)；流式細胞儀(Becton Dickinson)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1大鼠腎動脈平滑肌細胞的原代培養(yǎng) wistar大鼠處死，無菌條件下迅速取腎動脈，冷 PBS 漂洗，剔掉多余組織。縱向剖開，輕刮內(nèi)膜。中膜在冷 PBS 中漂洗，切成約 1 mm2組織塊，均勻貼于培養(yǎng)瓶底部，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)置于培養(yǎng)箱中 5-6 h，加入20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，靜置培養(yǎng)。

1.2.2大鼠腎動脈平滑肌細胞鑒定 細胞丙酮固定，PBS洗；0.5% H2O2稀釋的甲醇室溫20 min，PBS洗；山羊血清室溫20 min；α平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)抗體4 ℃過夜；PBS洗，二抗37 ℃ 30 min，PBS洗；SABC 37 ℃孵育20 min，DAB顯色10 min；自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，封片。

1.2.3實驗分組及模型的復(fù)制 成對數(shù)生長的RAMSC無血清培養(yǎng)24 h，加入藥物干預(yù)，分組如下，對照組：正常細胞培養(yǎng)(含5.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基)，不做任何處理；單純模型組(高糖+高胰島素)：加入葡萄糖25 mmol·L-1，胰島素(10-7mol·L-1)作用72 h；模型+CaSR激動劑：加入GdCl3(30 μmol·L-1)4 h后，再加入葡萄糖25 mmol·L-1，胰島素(10-7mol·L-1)作用72h；模型+CaSR抑制劑：加入NPS2143(10 μmol·L-1) 12 h后，再加入葡萄糖25 mmol·L-1，胰島素(10-7mol·L-1)作用72 h。

1.2.4Western blot檢測CaSR、PCNA及MMP-2的蛋白水平 細胞刮下后加入蛋白裂解液及PMSF，冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，上清液進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，90 mV轉(zhuǎn)移2 h至硝酸纖維素薄膜，封閉1.5 h；分別加入一抗CaSR、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP-2)(1 ∶500) 4 ℃過夜。洗膜，二抗(1 ∶10 000)孵育1 h，ECL發(fā)光，半定量分析 。

1.2.5細胞增殖周期的檢測 各組細胞胰蛋白酶消化后，PBS洗2次，細胞密度為1×106·L-1，離心2 000 r·min-1，5 min，PBS洗，離心同前，加3 mL預(yù)冷乙醇固定，4 ℃過夜，離心2 000 r·min-1，5 min，緩沖液洗滌，離心同前，加A液250 μL，室溫孵育10 min，加B液200 μL，室溫孵育10 min，加預(yù)冷C液200 μL，室溫避光10 min，上機檢測。

1.2.6Transwell小室法檢測細胞遷移 各組細胞離心，調(diào)整細胞濃度1.0×109/L種于上室，下室加入含有10% FBS的完全培養(yǎng)基600 μL，據(jù)分組情況向上室內(nèi)加入不同藥，培養(yǎng)72 h；上室取出后去除未遷移的細胞，PBS洗；甲醇固定上室細胞20 min；PBS洗，風(fēng)干，0.5%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗，風(fēng)干。將小室倒立，400倍正置顯微鏡下任意選取5個不同的視野，拍照并計數(shù)穿膜細胞數(shù)量。

1.2.7ELISA法檢測MMP-2含量 取各組細胞培養(yǎng)液，離心1 500 r·min-110 min，取1 mL上清液待測。按ELISA試劑盒說明書操作。各組均進行3個復(fù)孔檢測，均值為終質(zhì)量濃度。分別以標準物的質(zhì)量濃度及450 nm波長的吸光度值為橫縱坐標，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。在坐標曲線上通過樣品A值，查出相應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度。

1.2.8細胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測 細胞棄培養(yǎng)液，含鈣Krebs溶液沖洗。Fluo-4 AM 37 ℃避光孵育30 min；去除負載液，含鈣Krebs溶液沖洗，備用。在鏡下選取細胞狀態(tài)好，質(zhì)膜完整的細胞進行實驗。用激光掃描共聚焦顯微鏡監(jiān)測細胞內(nèi)鈣離子的變化，激發(fā)波長為488 nm。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎動脈平滑肌細胞鑒定為鑒定提取的原代大鼠RASMC，我們進行抗α-SMA免疫組化染色。結(jié)果如Fig 1，胞質(zhì)染成黃褐色，胞核不著色，胞質(zhì)中有較多的條絲狀物，與細胞縱軸平行，即為肌動蛋白。計數(shù)200個細胞，見10個細胞未染色，平滑肌細胞的純度為95%。

Fig 1 Identification of RASMCs (immunohistochemical staining ×400)

2.2 不同藥物處理對CaSR表達的影響為探究胰島素抵抗對CaSR表達的影響，我們通過Western blot實驗檢測了不同藥物處理后CaSR蛋白的表達情況。結(jié)果如Fig 2，與control組比較，HG+HI組CaSR表達增加(P<0.05)；與HG+HI組比較，GdCl3能增加CaSR表達(P<0.05)，CaSR抑制劑NPS2143的作用相反。

Fig 2 Effects of different treatment factors on

2.3 不同藥物處理對PCNA蛋白表達的影響PCNA是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標，為觀察CaSR活化對RASMC增殖的影響，我們觀察了不同藥物處理后PCNA蛋白表達的變化。結(jié)果顯示(Fig 3)：與control組比較，高糖和高胰島素能夠上調(diào)PCNA蛋白表達水平(P<0.05)；在此基礎(chǔ)上GdCl3能夠進一步增加其表達水平(P<0.05)； NPS2143則與GdCl3作用相反。

Fig 3 Effects of different treatment factors on PCNA

2.4 不同藥物處理對細胞周期及細胞增殖指數(shù)的影響為進一步探究CaSR活化對RASMC增殖的影響，我們又觀察了不同藥物作用后細胞周期及細胞增殖指數(shù)的變化。細胞增殖指數(shù)(PI)=(S+G2/M)/ (S+G2/M+G0/G1)。結(jié)果顯示：高糖和高胰島素組S和G2/M期細胞數(shù)量增多，PI高于對照組(P<0.05)，CaSR激動劑組PI高于HG+HI組(P<0.05)，NPS2143組PI明顯低于HG+HI組(P<0.05)，如Fig 4。

Fig 4 Effects of different treatment factors on cell cycle n=3)

2.5 不同藥物處理對細胞遷移的影響為研究CaSR活化對RASMC遷移的影響，我們做了Transwell小室實驗。結(jié)果顯示(Fig 5)：HG+HI組平均每個高倍視野穿過濾膜的細胞數(shù)明顯增加(P<0.05與control組比較)，提示高糖和高胰島素可增加RASMC的運動侵襲能力。高糖和高胰島素基礎(chǔ)上NPS2143能抑制細胞遷移，GdCl3能促進其遷移(P<0.05)。

Fig 5 Effects of different treatment factors

2.6 不同藥物處理對MMP-2蛋白表達的影響MMP-2能夠降解細胞外基質(zhì)，在細胞遷移過程中發(fā)揮重要作用，為觀察其在CaSR活化對RASMC遷移中的作用，我們通過Westen blot實驗檢測了不同藥物處理情況下MMP-2蛋白表達的變化。如Fig 6所示，HG+HI組MMP-2蛋白表達增加(P<0.05與control組比較)；高糖和高胰島素基礎(chǔ)上GdCl3和NPS2143分別能上調(diào)和下調(diào)這種作用(P<0.05與HG+HI組比較)。

2.7 不同藥物處理對細胞分泌MMP-2的影響為觀察MMP-2在CaSR活化對 RASMC遷移中的作用，我們又檢測了細胞上清液中的MMP-2含量。如Fig 7，HG+HI組細胞上清液中的MMP-2蛋白含量高于對照組(P<0.05)，但卻明顯低于HG+Gd組(P<0.05)，NPS2143則與GdCl3作用相反。

2.8 不同藥物處理對細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響為揭示CaSR活化促進RASMC增殖和遷移的機制，我們檢測了不同藥物處理后細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。在HG+HI組細胞內(nèi)鈣濃度增加(P<0.05與control組比較)，HG+Gd組細胞內(nèi)鈣離子濃度進一步上升(P<0.05與HG+HI組比較)，HG+NPS組鈣離子濃度下降(P<0.05與HG+HI組比較),如Fig 8所示。

Fig 6 Effects of different treatment factors on

Fig 7 Effects of different treatment factors on secretion of MMP-2 by RASMCs n=3)

3 討論

近年來，DM已成為威脅人類生命健康的“甜蜜殺手”，我國是DM患者最多的國家之一。作為慢性代謝性疾病DM有多種并發(fā)癥：嚴重代謝紊亂、感染性疾病、血管的病變及糖尿病足等，其中血管病變是DM致死致殘的主要原因[3]。DM大血管病變的臨床特點是血管功能及結(jié)構(gòu)異常，包括動脈硬化斑塊形成、血管僵硬度增加等。與其他血管損傷不同的是DM血管病變內(nèi)環(huán)境紊亂更加復(fù)雜，高血糖、胰島素抵抗及脂代謝紊亂等導(dǎo)致內(nèi)皮細胞更易損傷。失去內(nèi)皮保護的中膜平滑肌細胞暴露于多重刺激下,發(fā)生增殖、遷移并合成大量的細胞外基質(zhì)，沉積于血管壁[7]。研究表明[4]，鈣離子和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在動脈中膜平滑肌細胞表型改變以及增生、遷移過程中發(fā)揮重要作用。

Fig 8 Effects of different treatment factors on calcium ion concentration n=3)

鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，參與體內(nèi)很多重要的病理生理過程。近年來，CaSR在心血管系統(tǒng)中的功能及其在代謝性疾病，如高血壓、肺動脈高壓及糖尿病性心肌病變等中的作用正在被逐步揭示[8-10]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CaSR在動脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮細胞以及氣道平滑肌細胞中有表達,其活化影響細胞的增殖和遷移[11-12]。盡管CaSR 與動脈粥樣硬化關(guān)系密切，但其在DM血管病變中的作用卻鮮有報道。

高血糖及胰島素抵抗是DM患者的重要內(nèi)環(huán)境特征，也是引起機體出現(xiàn)各種病理改變的基礎(chǔ)。Malecki等[13]發(fā)現(xiàn)DM患者單核細胞CaSR表達增多，并依賴于空腹血糖濃度。Lu等[14]研究證實高糖促進大鼠主動脈內(nèi)皮細胞CaSR的表達，并可能參與內(nèi)皮細胞凋亡過程。本研究結(jié)果顯示：大鼠RASMC中存在CaSR蛋白的表達，高糖和胰島素能使其表達增加，CaSR激動劑上調(diào)此作用，抑制劑則相反，提示胰島素抵抗能夠活化大鼠RASMC的CaSR。

平滑肌細胞增殖是動脈硬化的重要原因，Zhu等[15]研究表明，在CaSR shRNA大鼠，吸煙引起的肺動脈增生明顯減弱。新近研究揭示缺氧活化的CaSR促進人肺動脈平滑肌細胞增殖和表型轉(zhuǎn)化，進而促進肺動脈高壓的發(fā)生和發(fā)展[4]。我們的結(jié)果亦顯示高糖和胰島素能促進RASMC增殖。這些作用能夠被CaSR激動劑GdCl3所增強，被其抑制劑所減弱，提示胰島素抵抗活化的CaSR參與了RASMC的增殖過程，是導(dǎo)致DM患者發(fā)生腎動脈硬化的原因之一。

血管平滑肌細胞遷移和表型改變是導(dǎo)致DM血管損傷的重要因素。Brennan等[16]研究表明活化的CaSR能夠促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，比如乳腺癌、前列腺癌等。本研究結(jié)果提示：胰島素抵抗活化的CaSR促進RASMC遷移過程。血管平滑肌細胞遷移受很多因素的影響，MMP是一類能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶家族，通過改變細胞和基質(zhì)的結(jié)合特性協(xié)助細胞遷移，在腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移中起促進作用。MMP-2是血管平滑肌細胞中表達的一種重要的MMP，能水解Ⅳ型膠原，是細胞穿越基底膜過程的重要物質(zhì)。本實驗結(jié)果提示，胰島素抵抗活化的CaSR通過增加MMP-2蛋白的表達，增強其降解細胞外基質(zhì)作用進而促進細胞遷移的進程。

同時，我們觀察到細胞內(nèi)鈣離子濃度隨著細胞增殖及遷移的程度而同步變化，鈣離子濃度升高，細胞的增殖及遷移指標相應(yīng)上調(diào)，而鈣離子濃度下降后，細胞增殖及遷移指標也隨之相應(yīng)下調(diào)。Lu等[17]報道：在缺氧條件下CaSR通過IP3受體導(dǎo)致鈣離子從肌漿網(wǎng)釋放，進而促進心肌細胞凋亡。本實驗結(jié)果提示：在胰島素抵抗活化的CaSR所介導(dǎo)RASMC增殖及遷移的過程中，鈣離子也起到了類似的中繼作用，并且促進了細胞的增殖與遷移。

綜上，胰島素抵抗活化的CaSR促進RASMC的增殖與遷移過程，進而參與DM腎血管硬化的形成，且鈣離子在此過程中扮演了重要的角色。本研究為DM腎動脈硬化的臨床治療提供了新思路與新視角。但由于本研究為體外細胞實驗，尚未建立動物模型驗證，另外細胞內(nèi)鈣離子濃度增加通過哪些具體分子機制促進RASMC的增殖和遷移，這些問題仍有待后續(xù)研究。