劉文莉 國 東 劉加霏 王玉珊 張煥虎 宋文剛

(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 132013)

SP1屬于SP/KLF(Kruppel-like factor)轉(zhuǎn)錄因子家族，可通過調(diào)節(jié)癌基因及抑癌基因、腫瘤細(xì)胞凋亡等方式，調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞生長周期相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑[1]。研究發(fā)現(xiàn)SP1與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在胃癌患者中，SP1高表達(dá)患者的生存時間明顯低于弱表達(dá)或者低表達(dá)的患者，下調(diào)SP1的過表達(dá)可以抑制胃癌腫瘤的增殖和瘤細(xì)胞的形成[2]。

微小RNAs (microRNAs)是真核細(xì)胞生物內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其成熟體通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，根據(jù)互補的程度指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶基因或阻礙mRNA的翻譯[3]。miR-7自2001首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)以來，在許多癌癥中表達(dá)降低，發(fā)揮抑癌基因的作用[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-7在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中均顯著下調(diào)，已逐漸成為胃癌診斷和治療的靶標(biāo)[5]。miR-7可通過抑制mTOR (mechanistic target of rapamycin)的表達(dá)，增強胃癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[6]；通過抑制上皮生長因子受體和胰島素樣生長因子1受體的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[7]?；谏鲜隼碚?，miR-7與SP1可能存在某種聯(lián)系，但目前沒有關(guān)于miR-7作用于SP1對胃癌參與調(diào)控的相關(guān)研究報道。

本研究擬通過構(gòu)建雙熒光素酶報告質(zhì)粒及突變質(zhì)粒，以闡述miR-7調(diào)控胃癌細(xì)胞SP1表達(dá)的分子機(jī)制，為研究miRNAs在胃癌中的作用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 細(xì)胞總RNA抽提取試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒購于TIANGEN公司；50 bp DNA ladder、D2000 DNA Marker、1 kb plus DNA ladder、Pro-Light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑購于天根生化科技(北京)有限公司；實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒、cDNA合成試劑盒、2×Taq酶、DNA 聚合酶、dNTP、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；miR-7 mimics、mimics-NC、miR-7 inhibitor購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于TaKaRa公司；Lipofectamine 2000 購于美國Thermo Scientific 公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天公司；SP1抗體、GAPDH抗體及二抗均購于武漢三鷹公司；PCR引物合成及測序由北京Thermo Scientific公司完成。大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α及雙熒光素酶報告載體psiCHECK2由威海市立醫(yī)院中心實驗室饋贈。

1.1.2細(xì)胞株 健康人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞株、人胃癌細(xì)胞株MKN45購于上海中科院細(xì)胞庫。

1.1.3儀器設(shè)備 MCO-18AIC 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Panas-onic,Japan)；ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、Synergy H4多功能酶標(biāo)儀、熒光定量PCR儀(Bio-Rad, USA)；Nano-200超微量核酸分析儀(奧盛, 廣州)。

1.2方法

1.2.1microRNA-7靶基因預(yù)測 利用Targetscan (http://www. targetscan.org/vert_72/)和miRDB (http://mirdb.org/)生物信息學(xué)技術(shù)相關(guān)軟件預(yù)測miR-7的靶基因以及miR-7與SP1-3′ UTR 序列配對分析。

1.2.2GES-1細(xì)胞的培養(yǎng)和基因組DNA提取 GES-1細(xì)胞株培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清+1%的青霉素/鏈霉素雙抗)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞匯合度為80%時，收集細(xì)胞，用細(xì)胞基因組快速抽提試劑盒，按照說明書提取細(xì)胞基因組DNA，用2%凝膠電泳檢測DNA完整性并用超微量核酸分析儀檢測濃度。

1.2.3PCR 擴(kuò)增SP1-3′UTR基因片段 從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載人源SP1基因序列(NM_138473.3)，應(yīng)用Prime primer5.0軟件設(shè)計SP1-3′UTR特異性引物，在引物的前端加入Xho Ⅰ 和Not Ⅰ 兩個限制性內(nèi)切酶位點和保護(hù)性堿基(表1)。以提取GES-1細(xì)胞的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增SP1-3′UTR區(qū)miR-7結(jié)合位點。PCR體系：2×Tap 10 μl，上引物0.5 μl，下引物0.5 μl，模板2 μl，水8 μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。使用凝膠回收試劑盒回收目的片段，用于后續(xù)連接反應(yīng)。

表1 用于擴(kuò)增SP1及3′UTR特異性引物序列

1.2.4野生型表達(dá)載體psiCHECK2-SP1-w-3′UTR的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物純化后采用Xho Ⅰ 和Not Ⅰ 雙酶切37℃過夜?；厥彰盖衅危迦氲綗晒馑孛笀蟾孑d體psiCHECK2的對應(yīng)位點，連接體系如下：3′UTR 7 μl，Xho Ⅰ、Not Ⅰ 雙酶切純化psiCHECK2 1 μl，10×T4 DNA buffer 1 μl，T4連接酶1 μl，水補至10 μl，16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選陽性克隆，按照DNA提取試劑盒說明書步驟，提取psiCHECK2-SP1-w-3′UTR質(zhì)粒進(jìn)行Xho Ⅰ、Not Ⅰ 酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒送去生工生物工程公司(上海)測序。

1.2.5突變型表達(dá)載體psiCHECK2-SP1-m-3′UTR的構(gòu)建及鑒定 以1.2.4中構(gòu)建的psiCHECK2-SP1-w-3′UTR為模板，分別以SP1-w-3′UTR-F和SP1-m-3′UTR-R1為引物擴(kuò)增片段F1，SP1-m-3′UTR-F1和SP1-w-3′UTR-R為引物擴(kuò)增片段F2，再以F1和F2為模板，以SP1-w-3′UTR-F和SP1-w-3′UTR-R為引物，通過融合PCR技術(shù)擴(kuò)增F3片段(對miR-7的結(jié)合位點進(jìn)行了連續(xù)4個堿基突變)，經(jīng)回收、酶切和純化后插入到雙熒光素酶報告載體psiCHECK2的對應(yīng)位點，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，經(jīng)測序后保存。

1.2.6細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將MKN45細(xì)胞接種于12孔板中，每孔2×106個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，分別將:psiCHECK2-SP1-w-3′UTR和miR-7 mimics、psiCHECK2-SP1-m-3′UTR和miR-7 mimics、psiCHECK2-SP1-w-3′UTR和miR-7 inhibitor、psiCHECK2-SP1-m-3′UTR和miR-7 inhibitor及各自陰性對照mimics-NC,通過Lipofectamine 2000進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，6 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后取出，用PBS洗滌3次，每孔加入1 ml總RNA裂解液，置搖床震蕩充分裂解后，離心吸取上清裂解液提取總RNA并測定濃度后，置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7雙熒光素酶報告基因活性檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后利用Synergy H4多功能酶標(biāo)儀讀取熒光值并計算相對熒光活性。

1.2.8RT-PCR檢測SP1和miR-7的表達(dá)變化 提取待分析細(xì)胞的總RNA和microRNA后，分別采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)條件為42℃ 15 min，85℃ 5 min后置-20℃保存?zhèn)溆?。按照UltraSYBR Mixture試劑盒說明書進(jìn)行實驗，采用2-ΔΔCT方法計算目的基因的倍性變化。每個實驗組設(shè)3個平行，重復(fù)3次實驗并記錄實驗結(jié)果。

1.2.9Western blot檢測SP1的表達(dá)變化 提取待分析細(xì)胞的總蛋白，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。GAPDH作為內(nèi)參。上樣30 μg蛋白進(jìn)行電泳，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉中37℃封閉1 h后添加一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗4次后添加辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后TBST漂洗4次，最后采用Pro-Light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯色，并用ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像。

2 結(jié)果

2.1microRNA7靶基因預(yù)測 使用Targetscan、miRDB和Cytoscape軟件對miR-7的靶基因進(jìn)行預(yù)測。Targetscan的標(biāo)準(zhǔn)是Contest+<-0.4,miRDB的標(biāo)準(zhǔn)是>80。將兩個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行交叉，得到46個目標(biāo)基因。利用在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)Cytoscape軟件(version 11.0)進(jìn)行可視化，建立包括蛋白質(zhì)和基因在內(nèi)的眾多生物分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖1A)。發(fā)現(xiàn)miR-7與SP1的3′UTR區(qū)有潛在結(jié)合位點(圖1B)。

2.2熒光素酶報告載體psiCHECK2-SP1-w-3′UTR的鑒定 以提取的GES-1細(xì)胞基因組為模板，PCR擴(kuò)增SP1-3′UTR目的片段，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增出的片段大小約為220 bp，大小與預(yù)期相符(圖2A)。采用凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物與載體psi-CHECK2連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌DH5a，經(jīng)氨卞抗性篩選挑取單菌落，經(jīng)PCR鑒定，挑選鑒定正確的菌落搖菌，抽提質(zhì)粒，經(jīng)Xho Ⅰ 和Not Ⅰ 雙酶切后驗證，在220 bp處可見酶切片段，與預(yù)期SP1片段大小相符(圖2B)。初步證實目的基因已經(jīng)插入到質(zhì)粒載體中。重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明，目的基因成功克隆入載體，并且其序列與 GeneBank中公布的一致。

圖1 miR-7靶基因預(yù)測網(wǎng)絡(luò)圖及與SP1 3′-UTR 序列配對分析Fig.1 miR-7 target gene prediction website and sequence pairing analysis of SP1 3′-UTRNote:A.miR-7 target gene prediction website;B.Sequence pairing analysis of SP1 3′-UTR with miR-7.

圖2 psiCHECK2-SP1-w-3′UTR的質(zhì)粒構(gòu)建及酶切驗證Fig.2 Construction of psiCHECK2-SP1-w-3′UTR and validation by enzyme digestionNote:A.Agar gel electrophoresis of SP1-3′UTR product by PCR;B.Agar gel electrophoresis of constructed wild plasmid verified by enzyme digestion.M1.DL2000 marker;M2.50 bp ladder;1.Target fragment;2,3.Verified by restriction endonuclease with two enzymes.

圖3 psiCHECK2-SP1-m3′UTR的質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定Fig.3 Construction of psiCHECK2-SP1-m3′UTR and validation by enzyme digestionNote:A.Agar gel electrophoresis of SP1-3′UTR product by PCR;B.Agar gel electrophoresis of constructed wild plasmid verified by enzyme digestion；C.Comparison of wild and modified 3′UTR sequences.M1.DL2000 marker;1.Target fragment F1;2.Target fragment F2;3.Fusion fragment;4.Verified by restriction endonuclease with two enzymes.

2.3雙熒光素酶報告質(zhì)粒psiCHECK2-SP1-m-3′UTR的鑒定 以2.2中構(gòu)建成功的熒光素酶報告載體psiCHECK2-SP1-w-3′UTR為模板。融合PCR技術(shù)依次擴(kuò)增片段F1、F2和F3(圖3A、B)。經(jīng)酶切及測序鑒定F3片段含有與miR-7結(jié)合的4個堿基突變位點，由TTCC突變?yōu)锳AGG(圖3C)。

2.4雙熒光素酶報告實驗 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，與陰性對照mimics-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-7-5p能顯著降低轉(zhuǎn)染psiCHECK2-SP1-w-3′UTR的MKN45細(xì)胞的相對熒光活性比值(Rluc/Luc)(P<0.001)，而對轉(zhuǎn)染psiCHECK2-SP1-m-3′UTR的MKN45細(xì)胞的Rluc/Luc未有明顯改變(P>0.05)(圖4)。

圖4 雙熒光素酶活性分析野生型與突變型psiCHECK2-SP1-3′UTR在胃癌MKN45細(xì)胞表達(dá)情況Fig.4 Analysis of dual relative luciferase activity of psiCHECK2-SP1-w-3′UTR and psiCHECK2-SP1-m-3′UTR in gastric cancer MKN45 cellsNote:Compared with the w-3′UTR+NC, Rluc/Luc of the w-3′UTR+miR-7,***.P<0.001；Compared with the m-3′UTR+NC,Rluc/Luc of the m-3′UTR+miR-7,ns.P>0.05.

圖5 miR-7模擬物及抑制劑對MKN45細(xì)胞中miR-7的表達(dá)影響Fig.5 Expression change of miR-7 in miR-7 mimic and inhibitor transfected MKN45 cellsNote:A.Compared with the miR-7-NC,expression of miR-7 in the w-3′UTR+miR-7-mimic,***.P<0.001;B.Compared with the miR-7-NC,expression of miR-7 in the w-3′UTR+miR-7- inhibitor,***.P<0.001.

圖6 miR-7模擬物及抑制劑對MKN45細(xì)胞SP1-mRNA的表達(dá)影響Fig.6 Expression of mRNA-SP1 of miR-7 mimic and inhibitor in gastric cancer MKN45 cellsNote:A.Compared with the miR-7-NC,expression of SP1-mRNA in the w-3′UTR+miR-7-mimic,***.P<0.001;B.Compared with the miR-7-NC,expression of SP1-mRNA in the w-3′UTR+miR-7- inhibitor,***.P<0.001.

圖7 miR-7模擬物及抑制劑對MKN45細(xì)胞中SP1蛋白的表達(dá)影響Fig.7 Expression of SP1 protein of miR-7 mimic and inhibitor in gastric cancer MKN45 cellsNote:A.Compared with the miR-7-NC,SP1 protein in the w-3′UTR+miR-7 mimic,***.P<0.001;B.Compared with the miR-7-NC,SP1 protein in the w-3′UTR+miR-7 inhibitor,***.P<0.001.

2.5miR-7在胃癌細(xì)胞中負(fù)調(diào)控SP1的表達(dá) miR-7 mimic及miR-7 inhibitor 轉(zhuǎn)染胃癌MKN45細(xì)胞，經(jīng)48 h培養(yǎng)提取細(xì)胞總RNA、microRNA和總蛋白，分別通過qRT-PCR和Western blot檢測SP1的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染陰性對照相比，轉(zhuǎn)染miR-7 mimic促使miR-7過表達(dá)(圖5A)，同時在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平抑制細(xì)胞內(nèi)SP1的表達(dá)(P<0.001)，而轉(zhuǎn)染miR-7 inhibitor則抑制內(nèi)源性miR-7的表達(dá)(圖5B)，同時促進(jìn)SP1的表達(dá)(P<0.001)(圖6和圖7)。

3 討論

正常情況下，SP1在體內(nèi)各種細(xì)胞中廣泛表達(dá)并受機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控，具有高度保守序列，通過直接與啟動子結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[7]，目前SP1已被公認(rèn)為是促癌蛋白，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮重要作用。已在多種腫瘤類型中得到證實，在胃癌、胰腺癌和乳腺癌等癌癥中則表現(xiàn)為高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的分級和分期、侵襲和轉(zhuǎn)移能力及患者的生存期和不良預(yù)后密切相關(guān)，如同一胃癌患者的胃癌組織中SP1的表達(dá)水平顯著高于周圍正常組織，且與腫瘤的浸潤程度呈正相關(guān)[8]；SP1高表達(dá)的胃癌患者的中位生存期顯著低于SP1低表達(dá)或不表達(dá)的胃癌患者[9]。SP1可以與Smad蛋白形成化合物，從而誘導(dǎo)Smad7的轉(zhuǎn)錄和過表達(dá)，并負(fù)向調(diào)節(jié)TGF-β途徑，從而影響胃癌細(xì)胞的生長、分化和凋亡[10]。SP1的異常激活還可以上調(diào)腫瘤相關(guān)因子和血管生成因子的表達(dá)，從而為腫瘤生長提供良好的微環(huán)境，并促進(jìn)胃和胰腺腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成[11]。SP1被血管內(nèi)皮生長因子的啟動子募集，因其表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了血管內(nèi)皮的增殖、血管生成并增加了血管的通透性，從而促進(jìn)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SP1表達(dá)的增加與胃癌患者預(yù)后的惡化程度呈正相關(guān)[12]。同樣，miR-7發(fā)揮抑癌基因的作用，miR-7在胃癌細(xì)胞中表達(dá)低下，可通過靶向胰島素樣生長因子受體1抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13]。譚海洋等[14]報道m(xù)iR-7上調(diào)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)microRNA與mRNA存在互補配對時，降解mRNA合成新生多肽鏈，抑制其翻譯，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移等一系列的重要生物學(xué)過程[15]。

本實驗通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-7的潛在靶基因，依據(jù)算法對 miR-7 靶分子的樣本群進(jìn)行評分，Targetscan的標(biāo)準(zhǔn)是Contest+<-0.4,miRDB的標(biāo)準(zhǔn)是>80，通過基因重組和PCR技術(shù)在胃癌細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染miR-7，分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平驗證了miR-7對胃癌細(xì)胞負(fù)調(diào)控SP1的表達(dá)情況。

在本研究中，對胃癌細(xì)胞MKN45共轉(zhuǎn)染miR-7模擬物和抑制劑，miR-7可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平抑制細(xì)胞內(nèi)SP1的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-7抑制劑后則逆轉(zhuǎn)對SP1的抑制作用。發(fā)現(xiàn)miR-7可能是胃癌細(xì)胞中負(fù)性調(diào)控SP1活性的重要反饋調(diào)控機(jī)制，并初步構(gòu)建psiCHECK2-SP1 3′UTR熒光素酶報告載體，通過雙熒光素酶報告實驗對miR-7負(fù)調(diào)控SP1的功能進(jìn)行驗證，以驗證miR-7通過調(diào)控SP1參與胃癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制。

本實驗擴(kuò)增出長度為220 bp的SP1 3′UTR基因序列，并將其連入熒光素酶報告載體，成功構(gòu)建了pisCHECK2-SP1 3′UTR表達(dá)載體。miR-7可能通過作用于SP1的 3′UTR區(qū)域?qū)υ摶蜻M(jìn)行靶向調(diào)控，實現(xiàn)對胃癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)。關(guān)于miR-7通過調(diào)控SP1參與胃癌發(fā)展的信號傳導(dǎo)機(jī)制，本課題組將會在后續(xù)研究中不斷探索。