張 園 朱天吉

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，呼和浩特 010000)

哮喘是一種屬于全球性難治的慢性呼吸道炎癥反應(yīng)疾病，以胸悶、喘息、咳嗽等反復(fù)發(fā)作為其臨床癥狀，發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響患者日常生活工作[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)廣泛分布于機(jī)體內(nèi)各種細(xì)胞和組織中，且具有調(diào)節(jié)作用的一種小分子RNA，在多種疾病發(fā)生時(shí)異常表達(dá)，有望作為診斷多種疾病的臨床指標(biāo)[2]。哮喘發(fā)生后，患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中miRNA表達(dá)失調(diào)[3]。微小RNA-34b-5p(microRNA-34b-5p，miR-34b-5p)在哮喘患者血清中呈高表達(dá)，可作為哮喘的臨床檢測(cè)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)[4]。Zhang等[5]研究顯示微小RNA-150(microRNA-150，miR-150)表達(dá)可抑制lncRNA BCYRN1表達(dá)，進(jìn)而影響氣道炎癥反應(yīng)。但miR-34b-5p、miR-150在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族哮喘患者PBMC中的表達(dá)水平及兩者聯(lián)合診斷哮喘的研究尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究通過(guò)初步研究miR-34b-5p、miR-150在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族、漢族哮喘患者PBMC中的表達(dá)水平，分析兩者聯(lián)合診斷價(jià)值，以期為內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族、漢族早期診治哮喘提供臨床參考資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般臨床資料 選取2013年1月～2014年1月本院確診的蒙古族哮喘患者120例為蒙古哮喘組，其中男58例，女62例；年齡23～64歲，平均年齡(43.02±10.68)歲。以同期本院就診的120例漢族哮喘患者為漢族哮喘組，其中男56例，女64例；年齡24～66歲，平均年齡(44.28±10.76)歲。并選擇同期健康體檢者120例(蒙古族63例，漢族57例)進(jìn)行對(duì)照研究為健康組，其中男60例，女60例；年齡22～65歲，平均年齡(43.96±10.70)歲。三組在性別、年齡等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的哮喘判定標(biāo)準(zhǔn)[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者符合哮喘納入標(biāo)準(zhǔn)；②所有研究對(duì)象祖籍三代均居住于內(nèi)蒙古地區(qū)；③無(wú)異族通婚史；④生理病理檢查資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有糖尿病、高血壓、慢阻肺等慢性疾病者；②患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫系統(tǒng)疾病者：③合并嚴(yán)重的慢性全身性疾病者；④合并急慢性感染者。哮喘嚴(yán)重程度分級(jí)：輕度：癥狀≥1次/周，但<1次/d，可能影響睡眠，夜間哮喘癥狀>2次/月，但<1次/周，F(xiàn)EV1≥預(yù)計(jì)值80%或PEF≥個(gè)人最佳值80%，PEF變異率為20%～30%。中度：每日有癥狀，影響活動(dòng)和睡眠，夜間哮喘癥狀>1次/周，F(xiàn)EV1預(yù)計(jì)值60%～79%或PEF個(gè)人最佳值60%～79%，PEF變異率為>30%。重度：每日有癥狀，頻繁出現(xiàn)，夜間哮喘癥狀經(jīng)常發(fā)生，體力活動(dòng)受限，F(xiàn)EV1預(yù)計(jì)值60%或PEF個(gè)人最佳值60%，PEF變異率為>30%。

1.1.2主要試劑 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于美國(guó)GE公司；TRIzol試劑盒、Reverse Transcription System試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix Kit均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1樣本采集及預(yù)處理 三組受試者于晨起空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血6 ml，分別置于兩個(gè)管中，其中一個(gè)用于炎癥因子測(cè)量；另一份置于含有EDTA-K2抗凝管中，以Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離所有樣本PBMC，保存于-20℃冰箱中，待測(cè)。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)兩組PBMC中miR-34b-5p、miR-150的表達(dá)水平 取出-20℃冰箱中保存的PBMC樣本，冰上解凍，參照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)加TRIzol裂解液，按其說(shuō)明書(shū)具體操作流程從PBMC樣本中抽提總RNA。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)抽提RNA樣本在波長(zhǎng)260 nm、280 nm處的吸光度(A)，以A260/A280比值在1.8～2.0，表示抽提RNA樣本純度良好。以純度良好的RNA樣本為模板，依照Reverse Transcription System試劑說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。依據(jù)SYBR Green PCR Master Mix Kit試劑盒操作說(shuō)明書(shū)配制目標(biāo)PCR反應(yīng)體系，將目標(biāo)cDNA擴(kuò)增、定量檢測(cè)。miR-34b-5p、miR-150均以U6為內(nèi)參。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-34b-5p、miR-150相對(duì)表達(dá)量。各引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-34b-5p、miR-150及內(nèi)參U6的引物序列Tab.1 Primer sequences of miR-34b-5p,miR-150 and internal reference U6

1.2.3檢測(cè)一秒用力呼氣流量(forced expiratory volume in one second,FEV1)占預(yù)測(cè)值的百分比(FEV1%) 所有受試者靜息30 min，利用肺功能儀行肺功能檢測(cè) FEV1%，連續(xù)檢測(cè)3次求平均值。1.2.4ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子水平 將試管中血液樣本進(jìn)行離心后取上清液，檢測(cè)所有受試者全血中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13含量，按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行含量檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1各組miR-34b-5p及miR-150表達(dá)水平、肺功能指標(biāo)、炎癥因子比較 漢族哮喘組和蒙古哮喘組患者miR-34b-5p、IFN-γ、IL-2水平及FEV1%均明顯低于健康組，miR-150、IL-4及IL-13顯著高于健康組(P<0.05)；蒙古族和漢族患者IFN-γ、IL-2水平及FEV1%比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；蒙古族miR-34b-5p水平顯著低于漢族；而miR-150、IL-4及IL-13水平顯著高于漢族(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組miR-34b-5p及miR-150表達(dá)水平、肺功能指標(biāo)、炎癥因子比較Tab.2 Comparison of miR-34b-5p and miR-150 expression levels,lung function indicators and inflammatory factors in each

2.2與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 根據(jù)所有哮喘患者疾病嚴(yán)重程度分為輕度(n=129)、中度(n=99)及重度(n=12)。以疾病嚴(yán)重程度為自變量(0=輕度，1=中重度)，以炎癥因子IFN-γ(實(shí)測(cè)值)、IL-2(實(shí)測(cè)值)、IL-4(實(shí)測(cè)值)、IL-13(實(shí)測(cè)值)、miR-34b-5p(實(shí)測(cè)值)、miR-150(實(shí)測(cè)值)、FEV1%(實(shí)測(cè)值)為自變量進(jìn)行有序Logistic多元回歸分析，結(jié)果顯示miR-34b-5p為疾病嚴(yán)重程度的保護(hù)因素(OR=0.081，P=0.023)，而miR-150為疾病嚴(yán)重程度的危險(xiǎn)因素(OR=20.898，P=0.015)，見(jiàn)表3。

表3 Logistic多因素回歸分析結(jié)果Tab.3 Logistic multivariate regression analysis results

2.3miR-34b-5p、miR-150表達(dá)水平預(yù)測(cè)內(nèi)蒙古地區(qū)哮喘疾病的效能分析 對(duì)三種檢測(cè)方式對(duì)兩族哮喘患者診斷的結(jié)果顯示，兩族患者開(kāi)展聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能均顯著優(yōu)于 miR-34b-5p及miR-150單一檢測(cè)(z=12.257,10.947,P<0.001)，見(jiàn)表4、圖1。

表4 PBMC中miR-34b-5p、miR-150表達(dá)水平及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)蒙古族哮喘發(fā)生的效能Tab.4 Expression levels of miR-34b-5p and miR-150 in PBMC and their combined predictive efficacy in Mongolian asthma

圖1 PBMC中miR-34b-5p、miR-150表達(dá)水平預(yù)測(cè)漢族及蒙古族哮喘發(fā)生的ROC曲線Fig.1 ROC curve of miR-34b-5p and miR-150 expression levels in PBMC predicting occurrence of asthma in Han nationality and Mongolian asthma

3 討論

哮喘是由多種炎癥細(xì)胞、炎癥因子參與引發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病，以氣流受阻為臨床特征，可引起肺臟甚至全身癥狀，嚴(yán)重影響患者身心健康及社會(huì)正?；顒?dòng)[7]。因此，尋找可早期診治哮喘的可靠指標(biāo)，對(duì)哮喘病情及時(shí)防控，是臨床醫(yī)學(xué)面臨的重要課題。

miRNA是機(jī)體內(nèi)一類(lèi)長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的RNA小分子，可參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫炎癥反應(yīng)等生化過(guò)程[8]。Huang等[9]研究顯示miR-199a-5p在哮喘患者血漿中表達(dá)上調(diào)，與肺功能指標(biāo)FEV1呈負(fù)相關(guān)，miR-199a-5p可調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程，并進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)哮喘疾病發(fā)生與發(fā)展。miR-98在哮喘患者外周B細(xì)胞中表達(dá)異常，與血小板反應(yīng)蛋白1具有負(fù)相關(guān)性，兩者共同影響哮喘發(fā)病進(jìn)展[10]。miR-1165-3p在哮喘患者血清中呈過(guò)表達(dá)，其可作為過(guò)敏性哮喘的診斷標(biāo)志物[11]。以上研究表明，miRNA表達(dá)異常與哮喘發(fā)作關(guān)系密切。miR-34在哮喘患者中下調(diào)，與自噬、纖維化、氣道炎癥、氣道重塑相關(guān)，miR-34是哮喘的潛在生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[12]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-34在慢性阻塞性肺病患者中表達(dá)下降，經(jīng)白藜蘆醇治療后表達(dá)上調(diào)，表明miR-34可能參與并影響肺部炎癥反應(yīng)過(guò)程。miR-34b-5p在哮喘患者血清中表達(dá)下調(diào)，其具有哮喘臨床診斷價(jià)值[4]。本研究中漢族哮喘組和蒙古哮喘組患者PBMC中miR-34b-5p水平均低于健康組，提示miR-34b-5p在哮喘發(fā)病進(jìn)展中起一定作用。miR-150在慢性阻塞性肺病中表達(dá)異常，其可能通過(guò)影響肺部炎癥和氣道上皮細(xì)胞，進(jìn)而影響慢性阻塞性肺病的發(fā)生、發(fā)展[14]。miR-150在髖部骨折引發(fā)的全身性炎癥和急性肺損傷血清中表達(dá)異常，可作為髖部骨折后急性肺損傷診斷和預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物[15]。以上研究表明，miR-150在肺部炎癥疾病中表達(dá)異常，其可能參與并影響肺部炎癥類(lèi)疾病。本研究中漢族哮喘組和蒙古哮喘組患者PBMC中miR-150水平均明顯高于健康組，且蒙古哮喘組患者PBMC中miR-150水平明顯高于漢族哮喘組，提示miR-150可能在不同種族哮喘發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮不同程度的作用。

哮喘患者常伴有肺功能改變特征，肺功能檢測(cè)可作為哮喘鑒別診療的重要方法[16]。哮喘發(fā)生時(shí)，與其密切相關(guān)的淋巴細(xì)胞Th1、Th2分泌的炎癥因子水平發(fā)生變化[17]。本研究中漢族哮喘組和蒙古哮喘組患者FEV1%，外周血中IFN-γ、IL-2水平均明顯低于健康組，IL-4、IL-13水平明顯高于健康組，且蒙古哮喘組患者外周血中IL-4、IL-13水平及PBMC中miR-150明顯低于漢族哮喘組，提示同一地區(qū)哮喘患者肺功能指標(biāo)、炎癥因子與健康組存在差異，肺功能指標(biāo)、炎癥因子可能影響哮喘。根據(jù)既往動(dòng)物模型研究結(jié)果顯示，miR-34b-5p是參與到巨噬細(xì)胞激活及極化的重要因素，過(guò)表達(dá)miR-34b-5p可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞功能激活，從而導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放[18]。而IL-4亦可以通過(guò)激活巨噬細(xì)胞參與到哮喘的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制中，二者之間可能存在顯著關(guān)系，但具體機(jī)制尚不清楚，而根據(jù)本次研究推測(cè)，蒙古族哮喘患者由于miR-34b-5p高表達(dá)可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞顯著極化，從而影響外周血中IL-4及IL-13的含量。同時(shí)還有研究結(jié)果顯示，敲除miR-150基因后會(huì)導(dǎo)致血液中性粒細(xì)胞含量顯著下降[19]，故可以認(rèn)為此基因表達(dá)可以顯著促進(jìn)炎癥反應(yīng)，根據(jù)兩族患者之間miR-150表達(dá)情況來(lái)看，漢族患者miR-150表達(dá)量顯著高于蒙古族，提示蒙古族患者哮喘發(fā)生后炎性反應(yīng)更加嚴(yán)重，這也證實(shí)了之前對(duì)于IL-4及IL-13的含量的研究結(jié)果。但上述均為筆者根據(jù)既往研究結(jié)果推測(cè)所得，其詳細(xì)機(jī)制還需要開(kāi)展大量的基礎(chǔ)研究及臨床對(duì)照研究證實(shí)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-34b-5p及miR-150是內(nèi)蒙古地區(qū)哮喘患者疾病嚴(yán)重程度的獨(dú)立影響因素。為miR-34b-5p疾病嚴(yán)重程度的保護(hù)因素，而miR-150為疾病嚴(yán)重程度的危險(xiǎn)因素。上述兩種miR與哮喘患者炎性因子的相關(guān)性在之前的研究已經(jīng)被證實(shí)，而本結(jié)果提示上述兩組指標(biāo)對(duì)哮喘疾病嚴(yán)重程度具有較好的判斷性，這與其在體內(nèi)受疾病影響的敏感度較高，且受其他因素的影響較小有關(guān)。同時(shí)本研究還顯示，PBMC中miR-34b-5p、miR-150對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)發(fā)生哮喘均有一定的診斷價(jià)值，但單獨(dú)診斷效能較低，兩者聯(lián)合能有效提升診斷的效能，但對(duì)于不同種族之間的二者診斷效能的比較還有待大樣本研究進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族哮喘患者PBMC中miR-34b-5p表達(dá)下調(diào)，miR-150表達(dá)上調(diào)，兩者聯(lián)合對(duì)哮喘診斷具有較高的診斷價(jià)值。但本研究實(shí)驗(yàn)樣本量較少，結(jié)果可能存在一定偏差，后期將加大研究樣本量進(jìn)行深入研究。