柏 濤，王靜麗，胡旭東，夏 冰，程海林，王 娟

武漢市金銀潭醫(yī)院 a.消化科，b.肝病科，c.感染科，武漢 430023

由于肝細(xì)胞癌(HCC)缺少特異性的早期癥狀，患者臨床確診時(shí)大多處于中晚期，無(wú)法進(jìn)行根治性手術(shù)，患者5年生存率不足5%[1]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代影像設(shè)備的不斷發(fā)展以及微創(chuàng)技術(shù)水平的不斷提高，在大型設(shè)備數(shù)字減影機(jī)的應(yīng)用下，對(duì)于無(wú)法進(jìn)行手術(shù)根治的HCC患者行肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)成為主要治療方式[2]。TACE介入治療可有效減少、阻斷腫瘤血供，從而導(dǎo)致腫瘤缺血、缺氧而壞死[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類缺乏開放閱讀框、長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。近年研究[4]顯示，lncRNA參與了機(jī)體各種生理以及病理過(guò)程，同時(shí)在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等過(guò)程中作為抑癌基因或致癌基因發(fā)揮相應(yīng)的正反饋調(diào)節(jié)作用或負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。lncRNA TINCR是一種非典型lncRNA，其在體細(xì)胞組織分化以及腫瘤進(jìn)程中均具有重要作用[5]。本研究探討分析HCC外周血lncRNA TINCR表達(dá)水平與TACE術(shù)后輔助性T淋巴細(xì)胞1(Th1)/Th2平衡及預(yù)后相關(guān)性，為進(jìn)一步揭示HCC介入治療的預(yù)后情況提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性選取2015年3月—2017年3月本院行TACE治療的HCC患者。隨機(jī)抽取在本院體檢的健康志愿者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)治療前經(jīng)超聲、CT或2種以上影像學(xué)檢查確診為HCC；(2)經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性肝癌；(3)凝血功能正常；(4)介入治療術(shù)前未接受放療或化療治療；(5)預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；(6)TNM分期 Ⅱ～Ⅲ 期；(7)患者自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腹水中至大量；(2)合并其他惡性腫瘤患者；(3)合并嚴(yán)重心腦血管疾病患者；(4)合并精神疾病患者；(5)哺乳期或妊娠期女性；(6)TACE治療后1個(gè)月內(nèi)并發(fā)嚴(yán)重感染患者；(7)合并自身免疫性疾病或免疫缺陷性疾病患者；(8)有TACE治療禁忌證患者。

1.2 方法

1.2.1 TACE治療方案 患者接受局部麻醉后，采用Seldinger穿刺法，經(jīng)皮股動(dòng)脈穿刺插管，將導(dǎo)管插入腫瘤供血?jiǎng)用}內(nèi)，隨后注入造影劑，進(jìn)行肝動(dòng)脈造影，仔細(xì)觀察患者腫瘤位置、腫瘤大小以及供血情況。隨后依次注入5-氟尿嘧啶(1000～12 000 mg)、比柔多星(40～60 mg)進(jìn)行栓塞化療，使用碘化油作為栓塞劑，部分患者可使用明膠海綿進(jìn)行栓塞，術(shù)后給予患者抑酸、保肝、水化支持以及抗菌藥物等治療。TACE治療每4周1次，每例患者最多進(jìn)行3次。

1.2.2 外周血lncRNA TINCR表達(dá)檢測(cè) 于TACE完成后7 d抽取患者清晨空腹外周靜脈血，對(duì)照組受試者于體檢當(dāng)日抽取清晨空腹外周靜脈血。室溫下靜置15～30 min，離心10 min(3000 r/min，4 ℃)，小心吸取上清液置于試管內(nèi)，再次離心10 min(2500 r/min，4 ℃)，留取上清后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。取上述血漿樣本，每份400 μl，采用Qiagen miRNeasy Serun/Plasma kit試劑盒使用說(shuō)明書提取血漿內(nèi)總RNA，并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RNA濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，使用real-time PCR檢測(cè)血漿中l(wèi)ncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量，TINCR上游引物5′-CCATCCCTCTGTAACCACCT-3′，下游引物5′-GTTGGGTCTAGATTCCAGCA-3′；使用Actin作為內(nèi)參基因，Actin上游引物5′-ATCATGTTTGCCTAGATCAACA-3′，下游引物5′-GATCTCTTGCTAAGCGTCCA-3′。引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。real-time PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用2-△△CT法表示lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè) HCC組患者于TACE完成后7 d抽取患者清晨空腹外周靜脈血，對(duì)照組受試者于體檢當(dāng)日抽取清晨空腹外周靜脈血，離心15 min(3500 r/min，4 ℃)，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清IFNγ、IL-2、IL-4以及IL-10水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司，檢測(cè)嚴(yán)格參照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 術(shù)后隨訪 TACE術(shù)后對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪方式包括門診隨訪、電話隨訪等，隨訪截止日期為2019年8月1日，以患者死亡作為隨訪終點(diǎn)事件。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由湖北省武漢市金銀潭醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：倫審2017-02A。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入HCC患者85例，其中男46例、女39例，年齡29～76歲，平均(55.72±14.29)歲；Child-Pugh分級(jí)A級(jí)26例、B級(jí)53例、C級(jí)6例；血管侵犯64例；腫瘤大小>5 cm 51例、≤5 cm 34例；臨床分期Ⅱ期44例、Ⅲ期41例。另選取對(duì)照組30例，其中男17例、女13例，年齡30～75歲，平均(54.28±15.20)歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

2.2 外周血lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量比較 HCC組患者外周血lncRN TINCR相對(duì)表達(dá)量(1.784±0.429)高于對(duì)照組(0.926±0.263)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.277，P<0.05)。

2.3 lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量與HCC患者病理特征分析 lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)與HCC患者血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤分期及血清AFP水平有關(guān)(t值分別為3.958、4.499、3.361、4.949，P值均<0.05)(表1)。

表1 lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量與HCC患者病理特征分析

2.4 Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 HCC組患者血清IFNγ、IL-2水平明顯低于對(duì)照組(t值分別為11.408、6.986，P值均<0.05)，而IL-4、IL-10水平明顯高于對(duì)照組(t值分別為6.426、6.909，P值均<0.05)(表2)。

表2 兩組受試者Th1/Th2細(xì)胞因子水平比較

2.5 HCC患者lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量與Th1/Th2細(xì)胞因子的相關(guān)性分析 HCC患者外周血lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量與血清IFNγ、IL-2水平呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-3.164、-3.270，P值均<0.001)，與患者血清IL-4、IL-10呈正相關(guān)(r值分別為2.963、3.044，P值分別為0.007、<0.001)。

2.6 lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量與患者預(yù)后關(guān)系 以lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量≥1.700作為高表達(dá)，85例HCC患者中l(wèi)ncRNA TINCR高表達(dá)患者47例，低表達(dá)患者38例。log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，lncRNA TINCR低表達(dá)患者生存情況明顯優(yōu)于高表達(dá)患者(χ2=4.182,P<0.05)(圖1)。

圖1 lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量與患者預(yù)后關(guān)系

3 討論

HCC血供75%～80%均來(lái)自于肝動(dòng)脈，TACE介入治療可有效阻斷HCC供血?jiǎng)用}，導(dǎo)致腫瘤組織缺血、缺氧而發(fā)生壞死，尤其對(duì)于中晚期HCC患者而言，由于癌細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)散，多合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，TACE是目前首選治療方案，但患者5年生存率仍然較低[6-7]。lncRNA目前已被證實(shí)在人體染色體重組、修飾過(guò)程中具有著重要的調(diào)控作用，可誘導(dǎo)組蛋白修飾，進(jìn)行RNA選擇性剪切，在基因啟動(dòng)子干擾以及蛋白質(zhì)活性中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)可作為腫瘤生物標(biāo)志物，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的診斷方面有重要價(jià)值[8-9]。研究[10]顯示，TINCR在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展，此外，抑制TINCR表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖而促進(jìn)細(xì)胞體外凋亡，認(rèn)為TINCR是膀胱癌治療的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，研究[11]顯示，在HCC組織中可出現(xiàn)TINCR的異常表達(dá)，并認(rèn)為該種異常表達(dá)與患者臨床病理特征有密切關(guān)系。

本研究選取TACE治療的HCC患者作為研究對(duì)象，分析患者外周血lncRNA TINCR表達(dá)情況及其與患者術(shù)后Th1/Th2平衡和預(yù)后相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，HCC患者TACE術(shù)后仍存在lncRNA TINCR的高表達(dá)，且表達(dá)情況與患者血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤分期及血清AFP水平有關(guān)，與相關(guān)研究[12-13]結(jié)果一致，提示HCC患者的lncRNA TINCR高表達(dá)與HCC的疾病進(jìn)展程度有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了lncRNA TINCR與HCC的發(fā)生發(fā)展具有著密切的聯(lián)系。

T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機(jī)體排斥腫瘤過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，Th1/Th2極化作為機(jī)體免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要影響[14-15]。Th1細(xì)胞可分泌IFNγ、IL-2等細(xì)胞因子，參與抗腫瘤細(xì)胞免疫過(guò)程；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，參與體液免疫過(guò)程，同時(shí)具有抗Th細(xì)胞作用[16]。在正常機(jī)體內(nèi)，Th1/Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，在惡性腫瘤患者中表現(xiàn)為Th1/Th2平衡破壞，出現(xiàn)Th1/Th2漂移。本研究結(jié)果顯示，HCC組患者血清IFNγ、IL-2水平明顯低于對(duì)照組，而IL-4、IL-10水平明顯高于對(duì)照組，提示與健康人群相比較，HCC患者表現(xiàn)為Th1細(xì)胞功能減弱以及Th2細(xì)胞功能升高，患者Th1/Th2細(xì)胞平衡以Th2作為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，與相關(guān)研究[17-18]結(jié)果一致，這種免疫功能的改變被認(rèn)為可能與腫瘤的發(fā)展有密切聯(lián)系。

分析患者lncRNA TINCR表達(dá)與Th1/Th2細(xì)胞平衡之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，HCC患者外周血lncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量與患者血清IFNγ、IL-2呈負(fù)相關(guān)，與患者血清IL-4、IL-10呈正相關(guān)，提示lncRNA TINCR與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，可能是TINCR調(diào)控腫瘤進(jìn)展的機(jī)制之一[19-20]，但仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究證實(shí)。此外，分析lncRNA TINCR表達(dá)對(duì)患者TACE治療后生存情況的影響，結(jié)果顯示，lncRNA TINCR低表達(dá)患者生存情況顯著優(yōu)于高表達(dá)患者，提示lncRNA TINCR與HCC患者治療預(yù)后密切相關(guān)，可作為患者預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在指標(biāo)[21]。關(guān)于lncRNA TINCR對(duì)HCC的影響，可能考慮lncRNA TINCR對(duì)患者機(jī)體免疫功能的調(diào)控，但是關(guān)于其具體的分子機(jī)制尚未闡明。

綜上所述，HCC血管介入治療患者術(shù)后外周血lncRNA TINCR表達(dá)明顯高于健康人群，而lncRNA TINCR表達(dá)與患者病理特征及Th1/Th2免疫平衡有密切聯(lián)系，可作為患者生存預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，值得進(jìn)一步深入研究分析。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：柏濤、王靜麗負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；夏冰、程海林、王娟參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；胡旭東負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。