程彥林，劉京，陳龍，雷詩融，鄒家偉，張霞，李仕澤

(茅臺學(xué)院資源環(huán)境系，貴州仁懷564500)

蛙屬Rana廣泛分布于歐亞大陸和美洲，目前該屬已報道51種(Frost，2020)，其中，中國記錄分布25種，貴州省記錄分布6種，分別為昭覺林蛙R.chaochiaoensis、徂徠林蛙R.culaiensis、峨眉林蛙R.omeimontis、威寧蛙R.weiningensis、鎮(zhèn)海林蛙R.zhenhaiensis和寒露林蛙R.hanluica(中國兩棲類，2020)。昭覺林蛙分布在貴州西部(伍律等，1986)，徂徠林蛙分布在貴州黃平等地(肖寧等，2019)，峨眉林蛙分布在貴州東部和北部(費梁等，2012)，威寧蛙分布在貴州西部威寧、水城等地(劉承釗等，1962)，鎮(zhèn)海林蛙分布在貴州梵凈山和雷公山(張雷等，2010；陳繼軍等，2014；魏剛等，2017)，寒露林蛙分布在貴州梵凈山和雷公山(陳繼軍等，2017；魏剛等，2017)。

2019年7月，在貴州桐梓黃蓮自然保護區(qū)進行兩棲動物調(diào)查時，于保護區(qū)內(nèi)(107°2′37.31″E，28°29′31.95″N，海拔1 666 m)采集到蛙屬成體標(biāo)本2號(表1)，經(jīng)形態(tài)學(xué)比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為大別山林蛙R.dabieshanensis，為貴州省兩棲動物新記錄。本文對其形態(tài)特征及生態(tài)習(xí)性進行描述，并初步探討其形態(tài)特征的地理變異，為蛙屬物種的系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)研究提供了新信息。

表1 樣品信息表Table 1 Information of samples used in this study

1 材料與方法

1.1 材料

2號標(biāo)本取肌肉組織保存于95%乙醇中，標(biāo)本浸泡于10%福爾馬林溶液中，保存于茅臺學(xué)院生物學(xué)標(biāo)本室。

1.2 形態(tài)鑒定與測量

對2號標(biāo)本使用游標(biāo)卡尺(200 mm，精度0.01 mm；無錫錫工量具有限公司)進行測量，測量依據(jù)《中國兩棲動物檢索及圖鑒》(費梁等，2005),并參照《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》(費梁等，2012)進行形態(tài)鑒定。

1.3 分子鑒定

以高鹽法提取肌肉組織的DNA。利用引物P7和P8(Simonetal.，1994)PCR擴增16SrRNA基因部分片段(528 bp)并測序。PCR擴增條件和步驟參照Chen等(2017)。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，大小符合要求的產(chǎn)物交上海生工生物公司測序。所得序列上傳到GenBank，登錄號為MT911420和MT911421。

在GenBank中下載蛙屬部分物種和蛙科Ranidae部分相近物種的16SrRNA基因，結(jié)合本次采集標(biāo)本所測序列，進行分子系統(tǒng)發(fā)育分析。以寶興樹蛙Zhangixalusdugritei、黑斑側(cè)褶蛙Pelophylaxnigromaculatus為外群(Wangetal.，2017)。所有序列在Clustal X v1.8(Thompsonetal.，1997)中進行比對，采用貝葉斯法(Bayesian-Inference，BI)重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。建樹之前，利用jModeltest v2(David，2008)基于AIC標(biāo)準選擇最適核苷酸替代模型。貝葉斯法運算中馬爾科夫鏈的蒙特卡羅方法(Markov chain，MonteCarlo process)設(shè)置為4條鏈(3條冷鏈1條熱鏈)同時運行，共運行10 000 000代，每100代抽樣一次，共得到100 001個樣本及其相對的似然值和模型參數(shù)。在運行500 000代后，似然值趨于穩(wěn)定，舍棄最初的500 000代(5 000個樣本)，用剩余的樣本構(gòu)建一致樹，并獲得系統(tǒng)樹的支系結(jié)構(gòu)和各支系的后驗概率。用MEGA v6.0(Tamuraetal.，2013)中的Kimura雙參數(shù)模型計算表1中所列蛙屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

本次采集標(biāo)本為成體雄性(TZ20160714018、TZ20160714019)，體型較大，體長53.9 mm和54.8 mm，其他部位量度見表2。吻端鈍尖，頭長略大于頭寬，吻棱明顯，瞳孔橢圓、橫置，鼓膜明顯，呈圓形，舌后端有明顯缺刻。前臂粗壯，手指纖細，指端鈍圓不膨大，指長序3>4>1≈2，內(nèi)掌突橢圓形，小而明顯，無外掌突；后肢細長，左右跟部重疊明顯，脛跗關(guān)節(jié)貼體前伸達眼至鼻孔之間，趾長序4>3>5>2>1，趾端無溝，趾間具2/3蹼，趾關(guān)節(jié)下瘤明顯:第四趾3個，第二、三、五趾各2個，第一趾1個。背部皮膚光滑，呈金色，背部有黑色斑點，背側(cè)褶明顯，從眼后角到腹股溝。生活時前肢、大腿、脛骨背側(cè)面有灰褐色橫紋，雄性婚墊灰褐色(圖1，圖2)。比較此次所采集的林蛙標(biāo)本和其他蛙屬物種的形態(tài)鑒定特征，發(fā)現(xiàn)本次采集的標(biāo)本形態(tài)特征與大別山林蛙模式產(chǎn)地標(biāo)本相符。

表2 貴州桐梓大別山林蛙成體標(biāo)本形態(tài)量度Table 2 Morphometric measurements of adult Rana dabieshanensis in Tongzi,Guizhou Province

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳距離

PCR擴增獲得線粒體16SrRNA基因片段長度為520 bp。T、C、A、G含量分別是25.9%、23.8%、29.7%、20.7%，A+T含量高于G+C。本文所用最適核苷酸替代模型為GTR+G+I。

基于貝葉斯算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，采自桐梓的林蛙標(biāo)本與大別山林蛙模式產(chǎn)地(安徽大別山)的標(biāo)本聚為一支，且有較高的支持率(0.98)?；贙imura雙參數(shù)模型估算本研究中所采用的蛙屬部分物種的遺傳距離(表3)為1.2%～14.8%，平均遺傳距離為8.1%。桐梓所采的林蛙標(biāo)本與大別山林蛙模式產(chǎn)地標(biāo)本間的遺傳距離為0.6%～0.8%，遠小于蛙屬物種間的遺傳距離。通過形態(tài)比較，在桐梓采集的林蛙標(biāo)本與大別山林蛙原始文獻(Wangetal.，2017)的描述吻合，系統(tǒng)發(fā)育分析也支持采自桐梓的林蛙標(biāo)本與大別山林蛙關(guān)系較近。

因此，結(jié)合形態(tài)比較與分子系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果，確定采集于桐梓的林蛙標(biāo)本為大別山林蛙，為貴州省兩棲動物分布新記錄。

2.3 生境描述

本次采集的大別山林蛙標(biāo)本分布在桐梓黃蓮自然保護區(qū)海拔1 650～1 700 m溪溝邊樹林茂密的草叢中，標(biāo)本發(fā)現(xiàn)時在草叢邊的道路上(圖4)。與其同域分布的兩棲類有棘腹蛙Quasipaaboulengeri、峨眉樹蛙Zhangixalusomeimontis、經(jīng)甫樹蛙Zhangixaluschenfui和斑腿泛樹蛙Polypedatesmegacephalus等。

3 討論

蛙屬物種在中國廣泛分布，大多數(shù)物種間形態(tài)較為相似，因此在野外很難對其進行鑒定(費梁等，2012)。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，采用形態(tài)比較結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)分析對物種進行鑒定的方法已廣泛應(yīng)用。

目前貴州省記錄的蛙屬物種6種，即昭覺林蛙、徂徠林蛙、峨眉林蛙、威寧蛙、鎮(zhèn)海林蛙和寒露林蛙(中國兩棲類，2020)。本文通過GenBank下載貴州已有報道的林蛙及其近緣種的16SrRNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，計算遺傳距離，發(fā)現(xiàn)本文采集的標(biāo)本和貴州省有記載分布的昭覺林蛙、徂徠林蛙、峨眉林蛙、威寧蛙、鎮(zhèn)海林蛙和寒露林蛙的遺傳距離分別為3.8%、1.2%、3.8%、14.8%、1.2%和2.5%，和大別山林蛙模式產(chǎn)地標(biāo)本的遺傳距離僅為0.6%和0.8%，僅較鎮(zhèn)海林蛙與徂徠林蛙間的遺傳距離大(0.4%)，遠小于其他蛙屬物種的遺傳距離。但有研究認為徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙處于物種分化過程中的并系階段，其物種分化還未完全完成(楊寶田等，2013)。因此，本文遺傳距離比較不將徂徠林蛙和鎮(zhèn)海林蛙納入。

采自桐梓的林蛙標(biāo)本與貴州已記載的6種蛙屬物種在形態(tài)上也存在明顯差異。頭體長53.9～54.8 mm，可區(qū)別于威寧蛙(35 mm左右)；無雄性線，區(qū)別于峨眉林蛙(有雄性線)和昭覺林蛙(有粉紅色雄性線)；顳褶明顯，區(qū)別于徂徠林蛙(細弱)、鎮(zhèn)海林蛙(弱)、寒露林蛙(弱)和峨眉林蛙(不顯)；趾端圓，趾端無溝，區(qū)別于威寧蛙的趾端吸盤小，具腹側(cè)溝；后肢貼體前伸達眼至鼻孔之間，區(qū)別于徂徠林蛙、鎮(zhèn)海林蛙、峨眉林蛙的后肢貼體前伸達鼻孔前方，威寧蛙的達鼻孔和吻端之間，寒露林蛙和昭覺林蛙的超過吻端。本次采集的大別山林蛙和模式產(chǎn)地標(biāo)本在形態(tài)上也存在一些差異，桐梓的指長序為3>4>1≈2，大別山的為3>1>4>2。但本次樣本數(shù)量有限，上述差異是否為適應(yīng)不同的環(huán)境而導(dǎo)致的形態(tài)變異，還有待采集標(biāo)本進行論證。

大別山林蛙為中國特有種，此前報道在我國的分布僅限于安徽岳西縣鷂落坪自然保護區(qū)，海拔1 150 m 左右的山區(qū)(Wangetal.，2017)。此次在貴州省桐梓縣黃蓮自然保護區(qū)內(nèi)(海拔 1 666 m)發(fā)現(xiàn)大別山林蛙，豐富了其分布信息，以及拓寬了對該物種分布海拔的認識。