朱英，李裕冬，何鳴，胡蘭，吳虹林*

(1.四川省自然資源科學(xué)研究院，成都610015；2.中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心，四川都江堰611800)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是脊椎動(dòng)物基因組中多態(tài)性極高的功能性多基因家族之一，它編碼的蛋白分子能夠識(shí)別、結(jié)合、呈遞抗原并激發(fā)一系列免疫反應(yīng)(Klein，1986)。MHC基因家族包括呈遞胞內(nèi)病原菌抗原的Ⅰ類(lèi)MHC基因和呈遞胞外病原菌抗原的Ⅱ類(lèi)MHC基因(Piertney &Oliver，2006)。

由于MHC基因編碼的蛋白質(zhì)分子在脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中扮演著重要的角色，瀕危物種的MHC基因得到了動(dòng)物保護(hù)工作者的關(guān)注，學(xué)界陸續(xù)開(kāi)展了諸如大熊貓Ailuropodamelanoleuca(Chenetal.，2010，2013；Zhuetal.，2013a，2013b)、川金絲猴Rhinopithecusroxellana(Luo &Pan，2013；Zhangetal.，2018)、林麝Moschusberezovskii(Lietal.，2014；Yaoetal.，2015)、紅腹錦雞Chrysolophuspictus(Zengetal.，2016a,2016b)、揚(yáng)子鱷Alligatorsinensis(Zhaietal.，2017；Hanetal.，2019)和朱鹮Nipponianippon(Lanetal.，2019；Sunetal.，2019)等瀕危動(dòng)物的MHC遺傳多樣性評(píng)估、MHC配偶選擇機(jī)制的解析、MHC與疾病的關(guān)系等研究，推動(dòng)了MHC基因在瀕危動(dòng)物保護(hù)中的應(yīng)用。

Zhu等(2019，2020)研究表明，MHC基因與大熊貓的配偶選擇以及抗寄生蟲(chóng)感染能力有密切的關(guān)系，前者研究表明大熊貓的MHC配偶選擇的機(jī)制影響了大熊貓的自然交配行為，以及大熊貓的繁殖成功率；雌性大熊貓偏愛(ài)特定MHC基因(Aime-C、Aime-I、DQ)是雜合子的雄性以及傾向于選擇與自身MHC(Aime-C、DQ、DR)基因型相異的雄性交配；MHC基因型差異越大的配偶之間交配成功率越高。后者研究表明大熊貓擁有西氏貝蛔蟲(chóng)Baylisascarisschroederi的MHC抗性基因；與MHC基因純合的大熊貓相比，MHC雜合的大熊貓不易感染西氏貝蛔蟲(chóng)，且感染程度也遠(yuǎn)低于MHC基因純合的個(gè)體。這些發(fā)現(xiàn)表明MHC基因的遺傳參數(shù)可以用于指導(dǎo)大熊貓的繁育計(jì)劃、寄生蟲(chóng)防控、野外放歸個(gè)體選擇等種群管理工作。因此，建立圈養(yǎng)種群的MHC遺傳檔案，并獲得遺傳多樣性等相關(guān)參數(shù)對(duì)于大熊貓的遺傳管理具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心擁有目前世界上最大的大熊貓人工圈養(yǎng)種群(截止2019年底，313只，約占人工圈養(yǎng)種群數(shù)量的50%以上)，該中心的大熊貓MHC遺傳參數(shù)將是我國(guó)人工圈養(yǎng)種群的遺傳管理的重要參考指標(biāo)。大熊貓MHC基因分型主要采取以聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術(shù)為基礎(chǔ)的單鏈構(gòu)象多態(tài)性的方法(Chenetal.，2010，2013；Zhuetal.，2013a，2013b)。該方法已成功應(yīng)用于大熊貓的10個(gè)經(jīng)典的MHC基因的分型工作中，包括4個(gè)Ⅰ類(lèi)MHC(Aime-C、Aime-F、Aime-I、Aime-L;Zhuetal.，2013a)和6個(gè)Ⅱ類(lèi)MHC基因(Aime-DRA、Aime-DQA1、Aime-DQA2、Aime-DQB1、Aime-DQB2和Aime-DRB3;Chenetal.，2013)。但該方法需掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術(shù)，且需要較高的時(shí)間成本(電泳 8～12 h，銀染1～3 h)和勞動(dòng)成本(Sunnucksetal.，2000)。故為每一只圈養(yǎng)大熊貓建立全面的MHC遺傳檔案是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作。鑒于MHC遺傳檔案的重要性，本研究在已有研究的基礎(chǔ)上，建立一種不需聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術(shù)且具備較低實(shí)驗(yàn)成本的分型方法，并對(duì)大熊貓的所有多態(tài)MHC基因進(jìn)行分型，構(gòu)建大熊貓的MHC遺傳檔案，以完善我國(guó)人工圈養(yǎng)種群的遺傳管理體系。

1 方法

1.1 樣品采集

本研究于2016年8月共收集91只大熊貓的糞便樣品，分別來(lái)自中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心雅安碧峰峽基地(n=32)、都江堰基地(n=21)、臥龍神樹(shù)坪基地(n=38)。為了不干擾大熊貓活動(dòng)，糞便樣品由中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心飼養(yǎng)員在08∶30大熊貓進(jìn)入室外活動(dòng)場(chǎng)地后在室內(nèi)采集，糞便的排出時(shí)長(zhǎng)小于12 h。糞便樣品在4 ℃的條件下2 h內(nèi)運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增、基因分型

在大熊貓的10個(gè)MHC基因中，Aime-F、Aime-DQB2和Aime-DRA位點(diǎn)在圈養(yǎng)種群中均只有1條等位基因(Chenetal.，2010；Zhuetal.，2013a)，不具有多態(tài)性，本研究排除這3個(gè)位點(diǎn)，采用其他7個(gè)多態(tài)的MHC位點(diǎn)(Aime-C、Aime-I、Aime-L、Aime-DQA1、Aime-DQA2、Aime-DQB1和Aime-DRB3)進(jìn)行遺傳變異分析。糞便DNA提取參考Zhu等(2017)的方法。

現(xiàn)有的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分型方法的開(kāi)發(fā)，在一定程度上歸因于高昂的測(cè)序費(fèi)用。隨著測(cè)序成本的大幅降低，直接測(cè)序法時(shí)間成本和勞動(dòng)成本的優(yōu)勢(shì)便得以凸顯。我們建立了直接測(cè)序法進(jìn)行基因分型的流程(圖1)。對(duì)于純合子個(gè)體的基因型，可以直接進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序并結(jié)合峰圖確認(rèn)。對(duì)于雜合個(gè)體的基因型，如果不同基因型的峰圖不同，可以通過(guò)堿基組合的特征進(jìn)行區(qū)分。如果不同基因型峰圖一致，需通過(guò)克隆分離等位基因進(jìn)行基因型的確認(rèn)。所有PCR產(chǎn)物都進(jìn)行雙向測(cè)序，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

利用已發(fā)表的基因特異性分型引物(Chenetal.，2013；Zhuetal.，2013b)，對(duì)采集的所有熊貓糞便DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化、直接測(cè)序、峰圖分析，進(jìn)行Ⅰ類(lèi)MHC基因的exon2-exon3(編碼α1和α2結(jié)構(gòu)域)以及Ⅱ類(lèi)MHC基因的exon2的分型。

Ⅰ類(lèi)MHC基因需要進(jìn)行exon2-exon3單倍型分型。單鏈構(gòu)象多態(tài)性法是分別對(duì)exon2和exon3進(jìn)行分型，再通過(guò)譜系驗(yàn)證確定exon2和exon3的連鎖關(guān)系。本研究將exon2的上游引物和exon3的下游引物進(jìn)行組合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物直接測(cè)序，通過(guò)測(cè)序峰圖堿基特征直接獲得exon2-exon3的單倍型信息。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有序列經(jīng)過(guò)手工校對(duì)后，利用MEGA X(Kumaretal.，2018)的Clustal W算法進(jìn)行比對(duì)，并計(jì)算核苷酸和氨基酸的變異位點(diǎn)數(shù)目。大熊貓Ⅰ類(lèi)MHC基因的抗原結(jié)合位點(diǎn)(antigen binding site，ABS)根據(jù)人Homosapiens的ABS進(jìn)行推斷(Zhuetal.，2013a)。使用Genepop 4.0進(jìn)行等位基因頻率計(jì)算和等位基因數(shù)目的統(tǒng)計(jì)(Rousset，2008)。

2 結(jié)果

除DQA1*0104和DQA1*0506外，大熊貓7個(gè)多態(tài)的MHC基因各自的等位基因兩兩組合，都能夠通過(guò)等位基因堿基組合的特征進(jìn)行區(qū)分。對(duì)于DQA1*0104或DQA1*0506雜合型，通過(guò)PCR擴(kuò)增、克隆分離等位基因，確定基因型。所有疑似為DQA1*0104或DQA1*0506這2種組合的最終均確認(rèn)為DQA1*0104雜合型，試驗(yàn)的大熊貓種群中不含DQA1*0506基因型的個(gè)體。

利用直接測(cè)序分型方法，從91只大熊貓中分離到45條MHC等位基因(22條 Ⅰ 類(lèi)MHC等位基因和23條 Ⅱ 類(lèi)MHC等位基因)。與已報(bào)道的 Ⅰ 類(lèi)和 Ⅱ 類(lèi)MHC等位基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了3條新的等位基因，1條來(lái)自Aime-I，命名為Aime-I*08；2條來(lái)自Aime-L，命名Aime-L*08和Aime-L*09。對(duì)于Aime-I位點(diǎn)，新等位基因Aime-I*08與已報(bào)道的Aime-I*01～07的差異核苷酸個(gè)數(shù)為26～35，差異氨基酸個(gè)數(shù)為13～16，ABS的差異氨基酸個(gè)數(shù)為9～12。對(duì)于Aime-L位點(diǎn)，新等位基因Aime-L*08與已報(bào)道的Aime-L*01～07差異核苷酸個(gè)數(shù)、差異氨基酸個(gè)數(shù)、ABS的差異氨基酸個(gè)數(shù)分別為1～26、1～15、1～11；新等位基因Aime-L*09與已報(bào)道的Aime-L*01～07的差異核苷酸個(gè)數(shù)、差異氨基酸個(gè)數(shù)、ABS的差異氨基酸個(gè)數(shù)分別為 2～17、1～9、0～7。Aime-L*08與Aime-L*02核苷酸序列相似度為99.8%(1個(gè)堿基差異)，氨基酸序列相似度為99.5%(1個(gè)氨基酸差異且位于ABS上)。Aime-L*09與Aime-L*03、Aime-L*04均具有2個(gè)核苷酸差異(相似度99.6%)和 1個(gè)氨基酸差異(相似度為99.5%)。但Aime-L*09與Aime-L*04 具有完全相同的ABS(表1；圖2)。

表1 新分離的等位基因與已報(bào)道等位基因的比較Table 1 The comparison of new MHC alleles and known alleles based on nucleotide and amino acid sequences

圈養(yǎng)大熊貓7個(gè)多態(tài)MHC基因的高頻等位基因(頻率>0.2)為：Aime-C*03、Aime-I*02、Aime-L*02和Aime-L*03、Aime-DQA1*01和Aime-DQA1*03、Aime-DQA2*01、Aime-DQB1*02和Aime-DQB1*04、Aime-DRB3*01和Aime-DRB3*09(表2)。

表2 圈養(yǎng)大熊貓7個(gè)多態(tài)MHC基因的等位基因頻率Table 2 Allele frequencies for 7 polymorphic MHC loci in the captive giant panda population

3 討論

本研究利用直接測(cè)序法成功構(gòu)建了91只大熊貓的7個(gè)多態(tài)MHC基因遺傳檔案，并分離得到3條新的Ⅰ類(lèi)MHC等位基因?，F(xiàn)有的大熊貓Ⅰ類(lèi)MHC基因的單倍型分型采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性的方法，該技術(shù)雖然能檢測(cè)1個(gè)堿基的突變，但是當(dāng)突變的位置靠近引物上下游時(shí)，檢測(cè)的靈敏度不佳。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，分離到的Aime-L*08與已報(bào)道的Aime-L*02相差1個(gè)堿基，且該差異堿基位于exon3的起始位置(靠近引物上游)。而Aime-L*09與Aime-L*04的2個(gè)差異堿基分別位于exon3的起始(靠近引物上游)和結(jié)束位置(靠近引物下游)。因此，推測(cè)Aime-L*08與Aime-L*09的單鏈多態(tài)性構(gòu)象與Aime-L*02、04非常相似，導(dǎo)致這2條等位基因沒(méi)有被單鏈構(gòu)象多態(tài)性的方法檢測(cè)出來(lái)。新等位基因Aime-I*08只在2只個(gè)體中被檢測(cè)到，低頻可能是導(dǎo)致Aime-I*08在其他種群中沒(méi)有被檢測(cè)到的原因。

單鏈構(gòu)象多態(tài)性分型方法的良好分型效果僅限于100～300 bp短片段(單堿基變異檢測(cè)率達(dá)到99%以上)，長(zhǎng)度大于400 bp的片段，20%左右的變異不能被檢出(Sunnucksetal.，2000)，不能滿(mǎn)足Ⅰ類(lèi)MHC基因exon2-exon3的單倍型的準(zhǔn)確分型(約600 bp)。本研究采用的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法可以直接得到Ⅰ類(lèi)MHC基因exon2-exon3的單倍型信息，不需要譜系進(jìn)行輔助推斷，而且不需要進(jìn)行耗時(shí)耗力的電泳和銀染工作。

直接測(cè)序法與單鏈構(gòu)象多態(tài)性法相比，時(shí)間成本和勞動(dòng)成本低，不需要掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染的顯色技術(shù)，可檢測(cè)出引物附近的堿基突變，可直接用于長(zhǎng)片段的分型(Ⅰ類(lèi)MHC基因的單倍型分型)。但是該方法適用于多數(shù)等位基因已被分離且序列已知、雜合子序列峰圖易于區(qū)分的MHC研究。對(duì)于MHC各基因的等位基因已知的物種，如金絲猴(Luo &Pan，2013；Zhangetal.，2018)、林麝(Lietal.，2014；Yaoetal.，2015)、紅腹錦雞(Zengetal.，2016a，2016b)、揚(yáng)子鱷(Zhaietal.，2017；Hanetal.，2019)和朱鹮(Lanetal.，2019；Sunetal.，2019)，如果具備不同雜合子基因型峰圖堿基易于區(qū)分的特點(diǎn)，也可采用直接測(cè)序法進(jìn)行基因分型。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，能夠自動(dòng)化且進(jìn)行長(zhǎng)片段的精確分型技術(shù)，如Pacbio單分子實(shí)時(shí)測(cè)序?qū)镸HC基因研究工作帶來(lái)便利。

致謝：感謝峨眉山方好瀕危動(dòng)物保育有限公司楊海瓊博士、南京林業(yè)大學(xué)劉宏毅博士提出的寶貴建議。