海 卓，熊顯榮，馬鴻程，閔星宇，郝振宇，張 賀，李 鍵，2

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041；2.西南民族大學青藏高原動物遺傳育種資源保護與利用教育部重點實驗室，四川成都 610041；3.西南民族大學動物科學國家民委重點實驗室，四川成都 610041)

實時熒光定量PCR是一種能夠通過實時熒光信號積累獲得目的基因表達水平的分子檢測技術.其具有操作簡單、靈敏度高和特異性強等特點，成為基因表達分析的一種重要工具.然而在檢測過程中提取的樣本RNA純度、反轉錄后獲得cDNA質量以及實驗操作過程中多種因素皆能影響實驗的準確性[1].因此，在進行目的基因檢測時常常引入單個或多個內參對目的基因進行數(shù)據(jù)校準.

內參基因又稱管家基因.就理論而言，同一內參基因受環(huán)境影響較小，在任何條件下的表達模式都應相對穩(wěn)定[2].但有研究發(fā)現(xiàn)，這些用于標準化矯正的內參基因在不同物種、組織和細胞中的表達模式并不相同，且存在較大差異[3-5].由此可見，對目的基因表達水平進行研究時，盲目選擇內參基因可能致使實驗結果失真.因此，在檢測不同物種、組織及細胞中目的基因mRNA表達水平時，預篩選出單個或多個穩(wěn)定表達的內參基因具有重要意義.

小鼠因其繁殖能力強、成本低等特點，已被廣泛用于各種相關生物學研究.睪丸是雄性動物精子發(fā)生及分泌雄性激素的場所，其發(fā)育是一個復雜而精密的生理過程[6-7]，隨著對雄性小鼠生殖相關分子水平的研究逐漸增多[8]，對不同年齡小鼠睪丸組織進行分子水平的相關研究是探究雄性生殖生理不可或缺的一部分，準確篩選出該組織最佳內參基因對雄性小鼠生殖研究具有重要的作用.目前關于小鼠的最優(yōu)內參基因篩選主要集中于大腦、小腸和肌肉等組織[9-10].因此，本研究以7種在小鼠不同組織中常見的表達穩(wěn)定的蛋白編碼基因(GAPDH、ARBP、β-actin、PPIA、SDHA、18S rRNA、HPRT1)作為候選內參基因[9-15]，檢測在小鼠睪丸中的表達水平、構建相應標準曲線并分析其在小鼠睪丸發(fā)育中的表達穩(wěn)定性.旨在獲得小鼠睪丸組織最適內參基因，以期為后續(xù)雄性小鼠生殖相關研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料收集

試驗所用昆明小鼠均來自于本實驗室.分別挑選1周齡(W 1)、3周齡(W 3)、6周齡(W 6)和9周齡(W 9)健康雄鼠，頸椎脫臼處死后迅速分離睪丸組織，用無菌眼科剪剪碎組織并分別置于RNase-free的1.5 mL EP管中備用.其中各周齡分別采集3只雄鼠睪丸，共計12個樣本.

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

根據(jù)Trizol法提取各睪丸樣本總RNA，用核酸分析儀檢測總RNA濃度和純度，用2%瓊脂糖凝膠電泳對總RNA進行檢測.最終選取OD260/280值在1.8～2.0之間且電泳出現(xiàn)2條完整條帶(18S和28S)的RNA樣本作為反轉錄模板，并根據(jù)TaKaRa公司的Prime-ScrptTMRT反轉錄試劑盒使用說明選取1μg總RNA為模板獲得cDNA，并將OD260/280值在1.8～2.0之間的樣本置于-20℃保存.

1.3 引物設計及標準曲線的構建

本試驗選取GAPDH、ARBP、β-actin、PPIA、SDHA、18S rRNA和HPRT1的蛋白編碼基因作為候選內參基因，依據(jù)NCBI在線系統(tǒng)中小鼠各基因編碼區(qū)(CDS區(qū))序列，并采用Primer5.0設計候選基因的熒光定量引物，最后送由金斯瑞生物科技有限公司進行合成(表1).將1.2中反轉錄得到的cDNA模板按照10倍稀釋法獲得5個濃度梯度cDNA進行qPCR反應.反應體系為15μL，包括ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA 1μL，ddH2O 5.5 μL.反應條件為:94℃預變性(3 min)；94℃變性(15 s)，60℃退火(30 s)，72℃延伸(35 s)，39個循環(huán)；并設置3個重復實驗組以構建標準曲線.

表1 候選內參基因引物序列Table 1 Sequences of primers of selected reference genes

1.4 實時熒光定量PCR檢測各引物特異性

以小鼠睪丸組織cDNA(10μmol/L)作為模板，反應體系及程序如1.3中的介紹，且每個檢測樣本設置3個重復組.

1.5 內參基因RT-qPCR數(shù)據(jù)處理及穩(wěn)定性分析

將候選內參基因RT-qPCR的3組重復循環(huán)閾值(Ct值)進行處理，分別減去最小Ct值，獲得△Ct值，進一步利用2-△△Ct法計算出各基因在睪丸組織中的相對表達量.輸入GeNorm程序中，通過對某一內參與其他內參表達水平兩兩比值進行對數(shù)變換，得出平均標準差作為候選基因在各個時期表達水平穩(wěn)定度的平均M值.其中M值越小，表示該候選內參基因的表達越穩(wěn)定，以此篩選出小鼠睪丸中最穩(wěn)定的內參基因.

2 結果與分析

2.1 睪丸總RNA質量分析

對所得睪丸總RNA進行完整性檢測，結果顯示(圖1)，所獲得的RNA均出現(xiàn)兩條清晰條帶(18S和28S)，且無明顯彌散的現(xiàn)象，所以沒有出現(xiàn)RNA降解，獲得的RNA完整性良好.利用核酸濃度測定儀分析各樣本OD260/280值均在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA純度較高.

圖1 睪丸組織RNA的電泳結果編號1～4分別為出生后1周、3周、6周和9周小鼠睪丸Fig.1 Electrophoresis of testicular RNA The numbers of 1～4 were represented the testes of mice at 1 week，3 weeks，6 weeks and 9 weeks after birth

2.2 候選基因引物特異性檢測

對設計的7個候選內參基因進行熒光定量PCR擴增及電泳檢測.結果顯示各引物皆出現(xiàn)清晰、單一條帶，無引物二聚體及雜帶(圖2).同時結合Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中的BLAST進行比對，確定設計各個內參基因引物的PCR產(chǎn)物長度與預期的相同.隨后對各個基因進行熔解曲線分析(圖3)，每個內參基因的3組重復實驗組溶解曲線皆出現(xiàn)單一信號峰且重合度極高，說明所設計的侯選基因引物在小鼠睪丸組織中均能特異性表達，可見各內參基因熒光定量分析引物特異性較好.

2.3 內參基因標準曲線的構建

構建GAPDH、ARBP、β-actin、PPIA、SDHA、18S rRNA和HPRT1標準曲線如圖4，7個基因對應的標準曲線以循環(huán)閾值(Ct值)為縱坐標，將以10為底數(shù)的拷貝數(shù)對數(shù)值作為橫坐標，由圖所示實驗樣平均Ct值皆＜30.5.且7個內參基因標準曲線的決定系數(shù)(R2)皆＞0.993，擴增效率都處于87.2%～104.1%之間(表2).因此，各個內參基因標準曲線有良好線性關系，滿足RT-qPCR實驗的擴增要求.

2.4 內參基因在不同發(fā)育階段的表達穩(wěn)定性分析

使用GeNorm程序將某一個內參基因與其他選擇的內參基因表達水平的兩兩比值經(jīng)對數(shù)變換，然后計算出的平均標準差作為基因表達穩(wěn)定性的平均值(M值).本研究所選7個管家基因PPIA、β-actin、ARBP、HPRT1、SDHA、18S rRNA和GAPDH對應的M值分別為0.513、0.513、0.804、1.154、3.179、4.481、5.021，表達穩(wěn)定性順序為PPIA=β-actin＞ARBP＞HPRT1＞SDHA＞18S rRNA＞GAPDH.如圖所示，7種候選內參基因最穩(wěn)定的是PPIA和β-actin，最不穩(wěn)定的為GAPDH(圖5).

圖2 內參基因PCR擴增結果M.DL2000 DNA Marker；標號1～7分別為β-actin、GAPDH、18S rRNA、PPIA、ARBP、SDHA和HPRT1基因的PCR擴增產(chǎn)物，不同數(shù)字代表產(chǎn)物條帶大小Fig.2 PCR result of reference genes M.DL2000 DNA Marker；The numbers of 1～7 were represented the gene PCR amplification product of β-actin、GAPDH、18S rRNA、PPIA、ARBP、SDHA and HPRT1，and different numbers represent the product band size

圖3 小鼠睪丸組織中7個內參基因RT-qPCR溶解曲線1.GAPDH；B.ARBP；C.β-actin；D.PPIA；E.SDHA；F.18S rRNA；G.HPRT1Fig.3 RT-qPCRmelting curves of 7 reference genes in testicles

圖4 7個內參基因標準曲線Fig.4 Standard curves of 7 reference genes

表2 小鼠睪丸組織7個候選內參的標準曲線相關參數(shù)Table 2 Standard curves of 7 candidate reference genes of mouse testicles

圖5 內參基因平均表達穩(wěn)定性Fig.5 The average expression stability values of reference genes

3 討論

本實驗利用RT-qPCR技術并結合GeNorm程序研究小鼠睪丸組織基因穩(wěn)定表達的最佳內參基因，在7個候選基因中PPIA是表達最穩(wěn)定管家基因之一.PPIA又稱親環(huán)素A(CypA)，是一種環(huán)孢素A(CsA)受體[11].已有研究表明，在小鼠出生后3周創(chuàng)傷性損傷的大腦皮質中PPIA是最佳內參基因[5].通過對感染甲型流感病毒(IAV)H1N1的小鼠肺細胞中多種管家基因表達穩(wěn)定性進行分析，發(fā)現(xiàn)PPIA亦是感染H1N1肺細胞的最佳管家基因之一[12].此外，GRIESSL M等人[13]通過將小鼠多種組織細胞進行體外培養(yǎng)后接種巨細胞病毒分析各組織管家基因表達情況得出PPIA同樣能夠在接種細胞病毒后的各組織中穩(wěn)定表達，這與本實驗結果一致.PPIA也最適用于人骨骼肌、免疫系統(tǒng)中的巨噬細胞與細胞外基質的相關基因分析[14-15].且在人的正常卵巢，癌卵巢和多囊卵巢以及子宮內膜癌細胞中PPIA亦是最佳內參基因[16-17].其次，有研究發(fā)現(xiàn)PPIA在禽類動物中的大腦、垂體和性腺發(fā)育過程中表達高度穩(wěn)定[18].以上結果與本研究對小鼠睪丸組織中內參基因篩選的結果皆一致.在對大鼠進行不同濃度硒元素喂食后研究其不同組織中最適內參基因發(fā)現(xiàn)，在大鼠睪丸組織中PPIA卻是一種穩(wěn)定性最低的內參基因[19]，這可能是由于本研究實驗動物為小鼠，與大鼠在生物分類中的種屬不同，所以致使實驗結果有所不同.但PPIA在雌性小鼠生殖相關的組織中表達穩(wěn)定性有待進行后續(xù)探究.

β-actin廣泛存在于生物的各種組織及細胞中，同時參與細胞骨架的維持、細胞遷移及分裂增殖等過程[20-21].因此在分析基因表達水平時，該基因是使用最為廣泛的內參之一.有研究報道，在小鼠N2a缺氧后再注后的損傷細胞中β-actin表達穩(wěn)定性最強[22].這與本實驗中對小鼠睪丸最佳內參基因篩選結果一致.且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)β-actin亦是雌性小鼠不同時期卵巢中相對穩(wěn)定的管家基因[23].但在小鼠C3H10T1/2間充質干細胞向軟骨分化的過程中對特定的部分基因表達進行分析，β-actin被歸為最不適合的內參基因之一[24].且在喂食不同濃度硒元素的大鼠睪丸中該內參基因并不是最適參考基因[19].除了對哺乳動物進行研究外，ZINZOWK W M[18]等人通過對禽類動物的多處組織進行熒光定量分析發(fā)現(xiàn)β-actin亦不能作為最佳內參基因.因此，更加證實篩選出不同物種的不同組織及細胞最適內參基因尤為重要，針對后續(xù)分子檢測試驗具有指導性作用.

最后，本研究結果顯示GAPDH在小鼠睪丸中表達穩(wěn)定性最差(M值=5.021).GAPDH是一種參與生物體轉錄翻譯出內糖代謝過程中的調控因子.在各組織及細胞中GAPDH與β-actin同為常用的管家基因，因此關于小鼠生殖相關的組織及細胞中GAPDH基因穩(wěn)定性分析有一些報道[23，25].楊顯英等人[23]對雌性小鼠卵巢中穩(wěn)定基因進行篩選時發(fā)現(xiàn)，GAPDH在小鼠不同發(fā)育時期卵巢組織中表達最為穩(wěn)定.FILATOV等人[25]發(fā)現(xiàn)小鼠GV期卵母細胞中多個候選內參基因中GAPDH亦或是最適內參基因.在小鼠巨細胞病毒感染過程中GAPDH是體外感染研究中最穩(wěn)定的參考基因[13].且通過對在小鼠小腸上皮細胞急性分析發(fā)現(xiàn)GAPDH和PPIA皆為其最適內參基因[9].但本研究結果表明，GAPDH并不適合于小鼠不同時期睪丸相關的研究實驗，因此不建議作為分析目的基因表達水平的最佳內參使用.且在小鼠結腸中GAPDH的表達也不穩(wěn)定，不能作為最優(yōu)內參基因[26].在對不同日齡的雄性胎鼠睪丸中最適內參基因的篩選結果發(fā)現(xiàn)，GAPDH作為最適內參基因之一用于后續(xù)研究，該結果與本研究結果不同可能是由于基因的表達具有時序性，因此，與成年小鼠睪丸中最適內參基因存在差異受年齡影響[27].由此可見，對不同生長時間段的雄性小鼠生殖進行深入研究之前，確定1個或多個相對表達穩(wěn)定的內參基因在一定程度上能夠提高檢測的相關目的基因表達水平準確性以及可信度.

4 結論

本研究結合RT-qPCR技術分析小鼠中7個常見候選內參基因在睪丸發(fā)育過程中表達穩(wěn)定性，其中PPIA和β-actin為小鼠睪丸發(fā)育過程中最適內參基因，GAPDH表達最不穩(wěn)定.因此，PPIA和β-actin為可作為出生后小鼠睪丸發(fā)育過程中最適內參基因，為進一步準確分析小鼠睪丸組織中目的基因的表達模式提供可靠的依據(jù).