王淑嫻，刁菁，樊英，蓋春蕾，宋愛(ài)環(huán)，吳海一，葉海斌

（山東省海洋生物研究院/山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266104）

維氏氣單胞菌亦被稱為維羅納氣單胞菌，隸屬氣單胞菌科（Aeromonadaceae）、氣單胞菌屬（Aeromonas）。維氏氣單胞菌由雜交群分類屬DHG8/10，致病菌株多數(shù)屬DHG8[1]。近年來(lái)不斷有研究表明維氏氣單胞菌是一種重要的水生生物病原菌，還能夠引起人畜共患病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)還會(huì)使人類產(chǎn)生肺炎、敗血癥以及食物中毒等病癥。養(yǎng)殖模式的集約化以及養(yǎng)殖從業(yè)者對(duì)各種抗生素的不合理應(yīng)用給淡水魚(yú)類疾病的預(yù)防和控制帶來(lái)極大的困難。2020 年山東某鯉魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)了以腹部腫脹，腸道充血并伴有一定腹水為主要癥狀的疾病，造成了所養(yǎng)鯉魚(yú)的大量死亡。該研究從瀕死病魚(yú)體內(nèi)的肝、脾、腎、腸道中分離純化得到一株疑似致病菌，并對(duì)該菌進(jìn)行了鑒定、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析和體外藥敏性研究，旨在為養(yǎng)殖鯉魚(yú)的疾病防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株分離：通過(guò)劃線法從患病鯉魚(yú)的肝、腎、脾、腸等內(nèi)臟組織中分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為S-1。

主要試劑和儀器：分離細(xì)菌所用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購(gòu)自北京陸橋生物試劑有限公司，基因組DNA 提取試劑盒、PCR 反應(yīng)所需PremixTaq DNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司，引物由上海生工合成，藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，PCR 儀、核酸微量測(cè)定儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自日本Bio-Rad 公司，微量加樣器購(gòu)自Eppendorf 公司。

1.2 細(xì)菌基因組DNA 提取

在TSA 平板上劃線接種細(xì)菌S-1，于細(xì)菌培養(yǎng)箱中28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌于EP管中，按照基因組DNA 提取試劑盒的說(shuō)明，提取細(xì)菌S-1 的基因組，使用核酸微量測(cè)定儀檢測(cè)核酸濃度，作為PCR 反應(yīng)的模板。

1.3 分子生物學(xué)方法鑒定

采用一對(duì)通用引物，對(duì)細(xì)菌S-1 的16S rRNA序列進(jìn)行測(cè)定。PCR 反應(yīng)體系：Premix Taq 酶 25 μL；正向引物（27 f）1 μL；反向引物（1492r）1 μL；S-1 基因組 1 μL；滅菌超純水 22 μL，共 50 μL 體系。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 1 min，55 ℃復(fù)性 1 min，72 ℃延伸 l min 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃溫育 10 min。吸取 6 μL 的 PCR 產(chǎn)物，經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳20 min，利用凝膠成像儀觀察并拍照。剩余PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登陸GenBank 進(jìn)行BLast 比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 藥敏性檢測(cè)

采用KB 紙片擴(kuò)散法[2]測(cè)定細(xì)菌S-1 的藥物敏感性。將純化的菌液進(jìn)行梯度稀釋，利用平板計(jì)數(shù)法配制的菌液濃度為1.0×108CFU/mL。吸取100 μL菌液均勻涂布在TSA 平板上，用無(wú)菌鑷子將各種抗生素藥敏片輕輕貼在培養(yǎng)基表面，28 ℃恒溫倒置過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏試紙片抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)，判斷菌株對(duì)藥物的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特性及鏡檢觀察

將細(xì)菌S-1 接種于TSA 培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，形成圓形，中央微隆，邊緣較整齊，淺黃色有芳香味的中等大小的菌落。經(jīng)過(guò)革蘭氏染色，可在顯微鏡下觀察到革蘭氏染色陰性，短桿狀，兩端鈍圓或直平的小桿菌。

2.2 基因組DNA 含量測(cè)定

將1 μL 細(xì)菌S-1 的基因組DNA 加入核酸微量測(cè)定儀中，經(jīng)檢測(cè)得知所提取的基因組DNA 的濃度為 120 ng/μL，OD260/OD280 值為 1.82，說(shuō)明DNA 純度較高，可以作為PCR 反應(yīng)的模板。

2.3 16S rRNA 基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果顯示細(xì)菌S-1 的16S rRNA 基因序列長(zhǎng)度為1453 bp，將該基因序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLast 檢索。比對(duì)結(jié)果顯示該菌與產(chǎn)氣單胞菌屬的16S rRNA 基因序列聚為一群，從同源性較高的序列中選取典型的序列，包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、梭形芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）、類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、燦爛弧菌（Vibrio splendidus）、鰻弧菌（V.anguillarum）、歐式弧菌（V.owensii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻膠弧菌（V.alginolyticus）的 16S rRNA 基因序列，利用MEGA 4.O 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果顯示細(xì)菌S－1 與兩株A.veronii（KY767536.1 和MN581681.1）聚合在一起（如圖1 所示）。

根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，將細(xì)菌S-1 鑒定為維氏氣單胞菌。

圖1 根據(jù)分離菌株S-1 的16S rRNA 基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

如表1 所示，該菌對(duì)氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢呋辛、米諾環(huán)素、氧氟沙星、哌拉西林、丁胺卡那、復(fù)方新諾明等抗生素高度敏感，對(duì)多西環(huán)素、新霉素、頭孢拉定、紅霉素、麥迪霉素等藥物中度敏感，對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星、羧芐西林、痢特靈、多粘菌素B、卡那霉素、苯唑西林、萬(wàn)古霉素、克林霉素、氨芐西林、青霉素等藥物不敏感。

3 討論

維氏氣單胞菌作為一種引起人-獸-魚(yú)共患病的病原菌，可導(dǎo)致多種水生生物發(fā)病，還可引起人類等哺乳動(dòng)物感染罹患多種疾病。人們治療時(shí)的不合理用藥，致使該菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，給魚(yú)類養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也給人類的公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重的威脅[3]，為此，維氏氣單胞菌越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。

表1 細(xì)菌S-1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

有研究者從患病淡水魚(yú)類中成功分離到維氏氣單胞菌，同時(shí)觀察其肝、腎、脾、腸、腦、鰓等實(shí)質(zhì)器官的病理組織學(xué)變化，結(jié)果表明患病魚(yú)類因多個(gè)組織器官出現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化而導(dǎo)致死亡[4-5]。還有研究者通過(guò)使用16S r DNA 的 RFLP-PCR 技術(shù)對(duì)患病的和健康的養(yǎng)殖虹鱒魚(yú)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)50 株菌株，其中維氏氣單胞菌占22%[6]。該研究從患病鯉魚(yú)中分離得到一株革蘭氏陰性細(xì)菌（S-1），16S rRNA 基因片段序列分析結(jié)果顯示，該菌的16S rRNA 基因序列與維氏氣單胞菌16S rRNA 基因序列的同源性最高，達(dá)到99%以上。MEGA 4.0 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上該菌與維氏氣單胞菌聚成一簇，鑒定該菌為維氏氣單胞菌。

維氏氣單胞菌對(duì)多種抗生素呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，這與養(yǎng)殖過(guò)程中亂用抗生素有很大關(guān)系。并且由于維氏氣單胞菌會(huì)導(dǎo)致人獸共患疾病，所以臨床的抑菌必須引起人們足夠的重視，合理選擇用藥，對(duì)于不同菌株選擇不同敏感的藥物進(jìn)行治療，防止盲目性的亂用藥。該研究采用藥敏紙片法檢測(cè)了從患病鯉魚(yú)分離得到的維氏氣單胞菌菌株對(duì)30 種抗生素的體外敏感性。結(jié)果表明：該菌株對(duì)氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢氨芐等14 種抗生素高度敏感，對(duì)多西環(huán)素、新霉素、頭孢拉定、紅霉素、麥迪霉素等11 種藥物具有耐藥性。維氏氣單胞菌對(duì)抗生素的耐藥性檢測(cè)，可以為氣單胞菌屬細(xì)菌感染疾病的防治提供科學(xué)參考。