康鐵柱,王堯堯,李海玲,葉菁,李福寶,方富貴

(安徽農業(yè)大學動物科技學院/安徽省動物遺傳資源保護與育種實驗室,安徽 合肥 230036)

Nesfatin-1是一種下丘腦攝食抑制肽,由其前體核組蛋白2(nucleobindin 2,Nucb2)加工而成[1],主要由腦部核團及胃X/A樣細胞、胰島β細胞分泌,相對分子質量9.7×103,可在下丘腦透過血腦屏障后進入腦脊液,進入血循環(huán)發(fā)揮作用[2],并廣泛表達于哺乳動物中樞神經系統(tǒng)和胃黏膜、胰腺以及睪丸等外周組織[3-4]。Nesfatin-1此前一直被認為在下丘腦參與控制食物攝入、體重和能量平衡[5],可以通過刺激室旁核(paraventricular nucleus,PVN)釋放催產素,還參與控制食欲下降[6],起著厭食作用,并且可以促進葡萄糖代謝和胰島素釋放[7]。腦室注射Nucb2重組蛋白可以抑制大鼠夜間攝食量和體重的增加,而注射 Nucb2抗體亦可顯著增加體重和攝食量[8]。在胰腺中,Nesfatin-1廣泛參與胰島素和胰高血糖素介導的葡萄糖代謝[9]。以上研究表明Nesfatin-1在能量平衡和神經內分泌相關功能以及編輯下丘腦的厭食信號方面具有負調節(jié)作用。能量平衡、代謝效率與初情期啟動及生殖活動密切相關,初情期開始和發(fā)育進程中對能量的儲備很敏感[10],這也提示了Nesfatin-1在生殖進程中可能發(fā)揮作用。在金魚體內,Nesfatin-1可以與促性腺激素共表達,參與下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonad axis,HPG)的調節(jié)[11];在奶牛的胎兒生長、能量儲存中,Nesfatin-1也起到積極作用[12]。

目前對Nesfatin-1的研究和報道較多,但是均缺乏對Nesfatin-1從生殖軸的表達到初情期調控的系統(tǒng)研究。因此,本研究以雌性大鼠為試驗動物,旨在探討以下3個問題:1)Nesfatin-1在下丘腦-垂體-卵巢軸(HPOA)中是如何分布的;2)Nesfatin-1在雌性大鼠的不同發(fā)育階段是如何表達的;3)Nesfatin-1是否影響雌性大鼠初情期。本研究結果將有助于我們進一步探明Nesfatin-1調控初情期啟動的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物從安徽醫(yī)科大學實驗動物中心購買200～220 g清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,飼養(yǎng)在室溫、12 h/12 h的明/暗循環(huán)(08:00—20:00開燈)的環(huán)境中,自由攝食與飲水,自由繁殖后取其子代進行后續(xù)試驗。

1.1.2 主要試劑Nesfatin-1/Nucb2抗體購買于R&D System公司;重組 Nesfatin-1蛋白購買于PL Laboratories公司,臨用前配制0.1 mg·mL-1Nesfatin-1 溶液;RNA 提取試劑 Trizol、DEPC購于美國Sigma 公司;實時熒光定量PCR(RT-qPCR)的反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒和基因引物均購自上海閃晶分子生物科技公司;大鼠雌二醇(Estradiol,E2)ELISA檢測試劑盒(CK-E30581R)購自上海傲集生物科技有限公司。

1.1.3 試驗儀器半自動切片機(LS-2055+,沈陽龍首電子儀器有限公司);光學顯微鏡(YS2-H,日本 Nikon 公司);電子分析天平(JA2003,上海浦春計量儀器有限公司);超凈工作臺(SW-CJ-ID,蘇州凈化設備有限公司);多用電泳儀(DYY-6C,北京六一儀器廠);熒光定量 PCR儀(Rotor-Gene 6000,Corbett Life Science,Australia);數顯腦立體定位儀(ZS-B-C,北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司);離心機(W3021HR,安徽嘉文儀器裝備有限公司);全自動酶標儀(G5033A,南京華東電子集團醫(yī)療裝備公司)。

1.2 試驗設計

Nesfatin-1在生殖軸定位試驗:選用6只體重為200～220 g成年雌性大鼠(80 日齡左右,未交配)進行生殖軸定位試驗;Nesfatin-1mRNA在生殖軸上的轉錄水平試驗:分別選取不同發(fā)育階段幼年期(10 日齡)、初情期前(25 日齡)、初情期(陰門開啟為標志,約40 日齡)、成年期(80 日齡,未交配)的雌性大鼠各6只,進行檢測。其中成年雌性大鼠取樣標準為建立2個連續(xù)的常規(guī)4 d發(fā)情周期[13]。大鼠側腦室注射試驗:選用24只初情期前(25 日齡)的雌性大鼠,隨機均分為試驗組和對照組,試驗組側腦室注射5 μL的50 pmol·μL-1Nesfatin-1溶液,對照組注射等體積生理鹽水。側腦室注射前先對25 日齡大鼠腹腔注射 50 mL·kg-1戊巴比妥鈉注射液(10 mg·mL-1)進行麻醉,待其完全失去意識后對頭頂部皮膚刮毛,75%乙醇消毒皮膚。注射部位及方法參照García-Galiana等[8]的報道。統(tǒng)計每只大鼠陰門開啟日齡并采集下丘腦、垂體和卵巢,稱量單側卵巢后迅速置于液氮后于-80 ℃保存。采集血液,離心后取血清,于-20 ℃保存。

1.3 免疫組化定位試驗

大鼠經腹腔麻醉后,經左心室插針管灌注200 mL的4%(體積分數)多聚甲醛固定30 min,迅速分離下丘腦、垂體、卵巢等組織,放入 4%多聚甲醛溶液中固定,72 h后進行常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm),切片經烘烤脫蠟后,用枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)修復抗原并滴加 3%(體積分數)H2O2滅活內源酶。5 mg·mL-1BSA室溫封閉1 h,在切片上滴加一抗 Nesfatin-1(1∶150稀釋)后置于 4 ℃冰箱內孵育過夜。滴加二抗 2-辣根酶標記抗山羊 IgG 多聚體(poly-HRP anti-goat IgG)37 ℃孵育 30 min后,PBS洗3次(每次5 min)。避光條件下用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色 5～20 s,終止反應并沖洗后用蘇木素染色,中性樹膠封片[14]。在光學顯微鏡下觀察并拍照。Nesfatin-1/Nucb2免疫反應陽性物質呈深淺不一的棕黃色,陰性對照用PBS代替一抗,陰性對照呈藍色,均無陽性物質的表達。

1.4 組織總RNA的提取

按照 Trizol 常規(guī)方法提取組織總RNA,將瓊脂糖凝膠電泳檢測到的高質量RNA用超微量分光光度計檢測其濃度和純度(D260/D280值為1.8～2.0),然后依據逆轉錄試劑盒操作說明,按20 μL反應體系進行逆轉錄(RT)合成cDNA第1條鏈,產物于-20 ℃冰箱保存待用。根據GenBank數據庫的序列,使用Primer Premier 5.0和AlleleID 6.0軟件設計引物,由上海閃晶分子生物科技公司合成并驗證后使用。引物序列見表1。

表1 本試驗RT-qPCR所用引物信息Table 1 RT-qPCR primers information in this study

1.5 組織中基因表達水平的RT-qPCR試驗

反應體系:2 μL cDNA、2 μL Primers、25 μL Buffer 和 0.5 μL SybrgreenⅠ加DEPC水至終體積為 50 μL。qPCR條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán)。內參選用β-actin基因。擴增各基因時,每個樣本重復3次。用 2-ΔΔCT法計算樣本中各基因的相對表達量。

1.6 血清中E2濃度的ELISA試驗

采集大鼠血液于4 ℃冰箱靜置4 h,在4 ℃條件下3 000 r·min-1離心15 min,取上清液。按照E2試劑盒說明書操作后,用全自動酶標儀測定每孔D450值。E2最低檢測濃度小于1.0 pg·mL-1,試劑盒批內變異系數小于10%,批間變異系數小于15%。

1.7 數據的統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 Nesfatin-1在雌性大鼠生殖軸上的定位

在成年雌性大鼠下丘腦中,Nesfatin-1蛋白在弓狀核(ARC)、室旁核(PVN)、視上核(SON)及下丘腦外側區(qū)(LHA)等核團均出現(xiàn)免疫陽性神經元分布(圖1-A);在垂體中,Nesfatin-1蛋白主要分布在細胞的胞質中,腺垂體胞體呈圓形、卵圓形、多角形等(圖1-B);在卵巢的卵母細胞、間質細胞、黃體細胞及顆粒細胞中均有表達(圖1-C)。神經元胞體呈棕色的反應顆粒位于胞質內,不同組織的陰性對照組均無目的蛋白著色(圖1-A8、B4、C4)。

圖1 Nesfatin-1 在成年雌性大鼠生殖軸上的定位Fig.1 Localization of Nesfatin-1 on reproductive axis in adult female ratsA1、A2. 弓狀核Arcuate nucleus(ARC);A3、A4. 室旁核Paraventricular nucleus(PVN);A5、A6. 視上核Supraoptic nucleus(SON);A7. 下丘腦外側區(qū)Lateral hypothalamic area(LHA);B1、B2、B3. 腺垂體Anterior pituitary;C1、C2、C3. 卵巢Ovary;A8、B4、C4. 陰性對照Negative control.ARC:弓狀核 Arcuate nucleus;TV:第3腦室 Third ventricle;PVN:室旁核 Paraventricular nucleus;SON:視上核Supraoptic nucleus;LHA:下丘腦外側區(qū) Lateral hypothalamic area. a. 卵母細胞Oocytes;b. 間質細胞Interstitial cells;c. 黃體細胞Corpus luteum;d. 顆粒細胞Granulosa cells.

2.2 Nucb2、Tac2、Gnrh mRNA在大鼠不同發(fā)育階段下丘腦中的表達

Nucb2、Tac2、GnrhmRNA在雌性大鼠幼年期(10日齡)、初情期前(25 日齡)、初情期(陰門開啟)和成年期的下丘腦均有表達。Nucb2、Tac2和GnrhmRNA表達水平均呈先上升后下降趨勢,且在初情期前達到最高(P<0.05)(圖2)。對Nucb2與Tac2mRNA表達進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)兩者變化趨勢大體一致,且呈極顯著正相關(r=0.940,P<0.001)。

圖2 Nucb2、Tac2、Gnrh mRNA在不同發(fā)育時期雌性大鼠下丘腦中的表達量Fig.2 The expression levels of Nucb2,Tac2,Gnrh mRNA in hypothalamus of female rats during different development periods*P<0.05. The same below.

2.3 Nesfatin-1對雌性大鼠初情期的影響

2.3.1 側腦室注射Nesfatin-1對大鼠陰門開啟時間、卵巢重及E2濃度的影響25日齡雌性大鼠側腦室注射Nesfatin-1后陰門平均開啟時間比對照組大鼠提前10 d 左右,初情期啟動顯著提前(P<0.05)。陰門開啟時卵巢重比對照組顯著增加(P<0.05),血清中E2濃度顯著上調(P<0.05)。

2.3.2 側腦室注射Nesfatin-1對大鼠生殖軸上生殖相關基因的影響對初情期前(25日齡)的雌性大鼠側腦室注射Nesfatin-1蛋白,到達初情期時下丘腦中Gnrh和ERα,垂體中GnrhR、LHβ和FSHβ以及卵巢中LHRmRNA相對表達水平顯著增加(P<0.05),但卵巢中FSHRmRNA相對表達水平差異不顯著(P>0.05)。

圖3 Nesfatin-1對雌性大鼠陰門開啟時間、單側卵巢重和E2濃度的影響Fig.3 Effects of Nesfatin-1 on vaginal opening time,unilateral ovarian weight and the concentration of E2 in female rats

圖4 Nesfatin-1對雌性大鼠生殖軸上生殖相關基因表達的影響Fig.4 Effects of Nesfatin-1 on expression of reproduction related genes in reproductive axis of female rats mRNA

3 討論

3.1 Nesfatin-1在雌性大鼠生殖軸上的表達

Nesfatin-1在雌性SD大鼠下丘腦的ARC、PVN、LHA和SON等部位表達豐富,與前人在豬[15]和雄性大鼠[16]下丘腦上的研究結果一致。形態(tài)學研究表明在下丘腦多個核團分布著 GnRH 神經元胞體及纖維,而與動物攝食、能量平衡以及生殖內分泌功能調節(jié)相關的神經元大部分也分布于此[17],Nesfatin-1/Nucb2 免疫陽性神經元在下丘腦的分布提示其可能在動物的能量代謝和生殖調節(jié)中起橋梁作用。Nesfatin-1免疫陽性細胞表達于腺垂體,而神經垂體未見其表達,腺垂體分泌生長激素、催乳素、促性腺激素,由此推測Nesfatin-1可能作用于GnRH神經元,或者直接作用于腦垂體,進而通過調控FSH和LH的釋放來參與生殖調控。在卵巢中Nesfatin-1主要定位于卵母細胞、間質細胞、黃體細胞及顆粒細胞,表明其可能直接參與卵巢的功能。本試驗中Nesfatin-1在雌性大鼠生殖軸的定位結果提示,Nesfatin-1可能在生殖軸具有系統(tǒng)性的調控作用,這為進一步研究其調控生殖的作用機制在形態(tài)學上提供了參考依據。

3.2 Nesfatin-1/Nucb2、Tac2、Gnrh mRNA在不同發(fā)育階段的雌性大鼠下丘腦的表達

本試驗結果顯示,在雌性大鼠的不同發(fā)育階段中Tac2與Nucb2mRNA表達呈正相關,這與García-Galiana等[8]對大鼠的研究結果相一致,提示兩者對初情期的調控可能具有相似的效應。而GnrhmRNA與Nucb2、Tac2mRNA 表達不一致的原因可能是GnrhmRNA激活晚于Nucb2、Tac2mRNA,并作為一個下游的調控因子。在大鼠中,神經激肽B(Neurokinin B,NKB)由Tac2基因編碼表達,初情期雌性大鼠NKB-NK3R信號能夠增加 GnRH、LH 分泌,作為初情期啟動因子,與kisspeptin等一起可刺激 GnRH 的釋放,這在不同物種上也得到了證實[18-21]。研究表明雌性大鼠外源性注射NKB蛋白可使陰門開啟時間顯著提前,GnrhmRNA表達水平顯著提升[22]。因此,初情期前Nucb2mRNA 的高表達可能通過某種機制促進 GnRH神經元的活化,從而激發(fā)性腺軸進而促進初情期啟動,這也暗示Nesfatin-1的表達與初情期啟動有潛在聯(lián)系。

3.3 側腦室注射Nesfatin-1對雌性大鼠初情期的影響

初情期啟動是由下丘腦-垂體-性腺軸(HPGA)活化引起的[23-24],當HPGA活化引起GnRH脈沖分泌頻率和振幅增加[25],作用于垂體前葉FSH和LH分泌細胞上的 GnRH受體促進垂體LH和FSH的分泌,后兩者作用于性腺,刺激卵巢分泌E2,從而促進生殖器官快速發(fā)育及性征的快速出現(xiàn),啟動初情期。本試驗中側腦室注射Nesfatin-1 后大鼠血清E2濃度及下丘腦ERαmRNA表達水平顯著升高,陰門開啟時間提前,說明Nesfatin-1促進大鼠初情期啟動,這與對大鼠側腦室持續(xù)存在抗Nesfatin-1的as-MONs使其下丘腦Nucb2含量下降,陰道開放延遲,卵巢重下降的結果相互驗證[8]。側腦室注射Nesfatin-1后大鼠下丘腦GnrhmRNA與垂體中的GnrhRmRNA表達水平均顯著提升,表明Nesfatin-1可通過調節(jié)GnrhmRNA來調控初情期,與體外用Nesfatin-1刺激下丘腦神經元釋放GnRH的結果相吻合[26]。側腦室注射Nesfatin-1后垂體FSHβ、LHβmRNA及卵巢中LHRmRNA表達水平均顯著上調,這可能與Nesfatin-1/Nucb2顯著增加雌性大鼠下丘腦GnrhmRNA 水平從而調控垂體FSHβ、LHβmRNA有關;而卵巢中FSHRmRNA的表達水平沒有差異,說明Nesfatin-1對FSHR與LHR的調控并不完全一致。本試驗結果提示:Nesfatin-1可能提前激活下丘腦GnRH神經元脈沖性的釋放,從而激活下丘腦-垂體-卵巢軸(HPOA),進而引起初情期的提前啟動,但是其具體神經內分泌的機制還有待進一步研究。

綜上所述,本試驗結果表明Nesfatin-1在雌性大鼠HPOA上廣泛表達,且從幼年期到成年期呈先上升后下降的變化規(guī)律;側腦室注射 Nesfatin-1可以引起雌性大鼠HPOA軸中Gnrh、GnrhR、FSHβ、LHβ、LHR、ERαmRNA表達水平的改變,導致雌性大鼠初情期提前。這些結果為探討性早熟的發(fā)生機制以及動物生產實踐中提早啟動初情期提供理論依據。