梅文晴,馮宇妍,姚志浩,倪迎冬,趙茹茜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生理生化重點實驗室,江蘇 南京 210095)

在畜牧養(yǎng)殖中,大量使用或濫用抗生素以提高養(yǎng)殖效應(yīng)所帶來的危害已為人們所熟知,而其在環(huán)境中的蓄積與食品中的殘留已給人類健康帶來了嚴重危害。為了人類自身安全的考慮,無抗養(yǎng)殖勢在必行。我國2020年1月1日起飼料中全面禁止添加抗生素。因此,研究和開發(fā)安全、綠色、環(huán)保型飼料添加劑已成為畜牧工作者的重要任務(wù)。益生菌是存在于自然界和動物體內(nèi)的有益微生物,因其在平衡腸道微生態(tài)中的有益作用而被廣泛應(yīng)用于飼料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健和食品等領(lǐng)域。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)將益生菌定義為“活性微生物,當(dāng)宿主攝入了足夠的量,會對宿主的健康產(chǎn)生有益的影響”[1]。目前,益生菌已越來越多地被用作抗生素的替代品[2]。

在家禽養(yǎng)殖中,益生菌已顯示出積極的生物學(xué)效應(yīng),包括增加肉雞平均日增重、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進腸道發(fā)育以及降低腸道中有害菌的數(shù)量[3-4]。研究報道,日糧中添加乳酸桿菌可以顯著提高肉雞腸道菌群多樣性并提高肉雞生長性能[5]。目前大多數(shù)研究主要集中在單一益生菌對肉雞生長性能的影響,然而與單一菌株相比,復(fù)合益生菌具有更全面、更容易通過消化道并在腸道中定殖的優(yōu)點[6]。Talebi等[7]研究表明,多菌株益生菌可提高肉雞的體重并降低飼料轉(zhuǎn)化率。此外,生長早期是動物生長發(fā)育的關(guān)鍵“窗口期”,肉雞腸道早期發(fā)育和微生態(tài)狀況對其后期生長起決定性作用。然而,早期添加益生菌是否促進家禽腸道內(nèi)有益菌的定殖、對腸上皮發(fā)育是否發(fā)揮積極影響尚未見報道。本研究以青腳麻雞為研究對象,在出雛至14日齡間的飲水中添加復(fù)合益生菌以觀測其對腸道細菌組成和腸上皮發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

將144只1日齡健康青腳麻雞隨機分為3組,分別為對照組(control,CON)、低劑量(50 mg·d-1)益生菌組(low-dose probiotic,LP)和高劑量(100 mg·d-1)益生菌組(high-dose probiotic,HP),每組6個重復(fù),每個重復(fù)8只雞。在飲水中添加益生菌,連續(xù)飼喂2周。試驗期間記錄采食量和體重,在14日齡時每組隨機選取6只健康肉雞,每個重復(fù)隨機選取1只,斷頸處死,采集十二指腸、空腸和回腸黏膜上皮組織,快速置于液氮中速凍,后移入-80 ℃保存?zhèn)錅y;取盲腸內(nèi)容物并儲存于-20 ℃?zhèn)錅y;小腸各段組織樣品放入4%甲醛緩沖溶液中固定以待制成切片。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗在南京市青龍山雞場進行。雛雞自由飲水、采食。日糧原料組成和營養(yǎng)組成及水平如表1所示。

表1 日糧原料組成和營養(yǎng)組成及水平Table 1 Ingredients and nutrient composition of diets

1.3 益生菌來源與成分

試驗用復(fù)合益生菌為雙歧桿菌、乳酸桿菌、糞鏈球菌和酵母菌復(fù)合活菌制劑(江蘇恒豐強生物技術(shù)有限公司)。制劑中的雙歧桿菌和乳酸桿菌均不少于1.0×107CFU·g-1,貝氏酵母菌和糞鏈球菌均不少于1.0×106CFU·g-1。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 生長性能測定記錄雛雞1、7及14日齡體重與采食量并計算料重比。

1.4.2 雛雞小腸絨毛高度和隱窩深度的測定將十二指腸、空腸和回腸上皮組織樣本進行脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊制作石蠟切片,石蠟切片進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色。每組3個樣本,每個樣本連續(xù)切片2張,每張切片選取3個不同視野,采用Image-pro plus測量絨毛高度和隱窩深度并計算其比值。

1.4.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測基因表達用Trizol(Invitrogen,USA)試劑提取各段小腸黏膜上皮組織中總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進行RT-qPCR,檢測各段腸道相關(guān)基因mRNA的表達,主要包括閉合蛋白基因(occludin gene,OCLN)、閉鎖小帶蛋白1基因(zonula occludens-1 gene,ZO1)、緊密連接蛋白蛋白(claudin 1 gene,CLDN1)、黏蛋白2基因(mucin 2 gene,MUC2)。PCR條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共40個循環(huán)。各基因相對表達量計算采用2-ΔΔCT法。引物由北京擎科生物工程有限公司合成。引物序列見表2。

表2 本試驗PCR引物序列Table 2 PCR primers sequence in this study

1.4.4 微生物16S rRNA基因測序采用SDS法提取樣本基因組的DNA,再進行PCR擴增和產(chǎn)物的混樣和純化,使用Ion S5TMXL上機測序。將得到的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進行拼接、過濾得到最終的有效數(shù)據(jù)(clean reads)。利用Uparse軟件[8]對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類,以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),對OTU序列進行物種注釋,用Mothur方法與 SILVA132 的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析[9],獲得分類學(xué)信息并分別在界(kingdom)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。用MUSCLE[10]軟件進行快速多序列比對,得到所有OTU序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對樣品中數(shù)據(jù)量最少的進行均一化處理,后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌對肉雞生長性能的影響

由表3可知:與對照組相比,HP組肉雞體重較高,14日齡時體重增加約7%,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);1～7日齡間肉雞平均日采食量顯著下降(P<0.05),料重比極顯著降低(P<0.01)。與CON相比,LP組肉雞以上指標(biāo)未見明顯差異(P>0.05)。

2.2 益生菌對肉雞小腸上皮形態(tài)的影響

由表4可知:與CON相比,HP組肉雞十二指腸絨毛長度增加(P=0.063),隱窩變淺(P<0.05),絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C)極顯著升高(P<0.01);LP組隱窩變淺(P<0.05)。與CON相比,HP組空腸和回腸絨毛高度極顯著增加(P<0.01),回腸V/C值顯著升高(P<0.05);LP組回腸隱窩深度降低(P>0.05)。

表4 益生菌對肉雞十二指腸、空腸和回腸組織形態(tài)的影響(n=3)Table 4 Effects of probiotics on the morphology of duodenum,jejunum and ileum of broiler chicks

2.3 益生菌對肉雞小腸上皮緊密連接相關(guān)基因mRNA表達的影響

由圖1可知:與CON相比,HP組回腸ZO1和OCLNmRNA表達水平顯著上調(diào),盲腸黏膜中ZO1和CLDN1mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);LP組盲腸黏膜中MUC2mRNA表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)。與LP組相比,HP組回腸黏膜上皮ZO1和OCLNmRNA及盲腸黏膜上皮ZO1表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖1 益生菌對肉雞腸道黏膜上皮中緊密連接相關(guān)基因mRNA表達的影響(n=6)Fig.1 Effects of probiotics on the mRNA expression of tight junction-related genes in intestinal mucosal epithelium of broiler chicks

2.4 益生菌處理對肉雞盲腸內(nèi)容物微生物菌群的影響

由圖2-A可知,稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性,并間接反映樣本中物種的豐富程度,當(dāng)樣品測序數(shù)量超過40 000時,曲線趨向飽合,說明測序數(shù)據(jù)量漸趨合理,更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種(OTU)。各組盲腸菌群在門水平主要以厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主,與CON組相比,HP組中厚壁菌門的相對豐度下降,而變形菌門和擬桿菌門的相對豐度增加(圖2-B)。在屬水平上,盲腸內(nèi)容物中菌群主要以Faecalibacterium、Alistipes和Lactobacillus等屬為主(圖2-C)。與對照組相比,LP組肉雞盲腸內(nèi)容物菌群中Eisenbergiella屬的豐度顯著降低(P<0.05),而HP組肉雞盲腸內(nèi)容物菌群中Sellimonas和Intestinimonas屬的豐度顯著增加(P<0.05)(表5)。Metastat分析結(jié)果顯示,與對照組相比,HP組肉雞盲腸內(nèi)容物菌群的Akkermansiaceae科的豐度極顯著增加(P<0.01)(圖2-D)。由表6可見:3組的Alpha多樣性指數(shù)覆蓋率接近1.00,表明每組的數(shù)據(jù)可以反映真實的盲腸微生物群水平。從observed_species和PD_whole_tree指數(shù)來看,HP組中盲腸微生物菌群的豐度分別比對照組高14.7%和13.8%,但3組間Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù)無顯著差異。

圖2 益生菌對肉雞盲腸內(nèi)容物微生物菌群的影響Fig.2 Effects of probiotics on microflora of cecal contents in broiler chicksA. 稀釋曲線;B. 門水平盲腸內(nèi)容物物種相對豐度;C. 屬水平盲腸內(nèi)容物物種相對豐度;D. 基于Metastat科水平物種的多樣性分析。 **表示HP組與CON組相比差異極顯著(P<0.01)。A. Rarefaction curve;B. Relative abundance of species at the phylum level;C:Relative abundance of species at the genus level;D:Analysis of the species diversity at family level based on Metastat. ** means the difference between HP group and CON group is significant at the 0.01 level.

表5 益生菌對盲腸內(nèi)容物屬水平菌群豐度的影響(n=3)Table 5 Effects of probiotics on abundance of cecal contents microorganism in genus

表6 益生菌對肉雞盲腸內(nèi)容物菌群多樣性和豐度的影響(n=3)Table 6 Effects of probiotics on the diversity and abundance of cecal contents in broiler chicks

3 討論

益生菌可以改善腸道黏膜屏障功能從而提高肉雞的生長性能[11]?？莶菅堪麠U菌fmbJ能顯著提高肉雞飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)[12]。但也有研究報道,益生菌對肉雞FCR影響很小或沒有影響[13]。本試驗結(jié)果顯示,添加高劑量益生菌能顯著降低1～7日齡肉雞的料重比。以上研究結(jié)果的不一致性可能與益生菌的菌株、劑量、添加起止時間及飼料成分等因素有關(guān)[14]。

小腸上皮結(jié)構(gòu)是營養(yǎng)物質(zhì)被消化和吸收的基礎(chǔ),而絨毛高度、隱窩深度及其比值是決定物質(zhì)消化和吸收的關(guān)鍵因素。絨毛高度增加可以擴大營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收面積,提高小腸的吸收能力[15]。研究發(fā)現(xiàn)采食益生菌后可引起小腸結(jié)構(gòu)的顯著變化,如Samanya等[16]發(fā)現(xiàn)納豆枯草芽胞桿菌顯著增加小腸的絨毛高度,Song等[17]也得到了類似的結(jié)果。本試驗結(jié)果也顯示益生菌對腸道絨毛高度、隱窩深度及其比值有積極影響。與LP組相比,HP組肉雞小腸絨毛高度顯著增加,這提示高劑量益生菌效果優(yōu)于低劑量益生菌。腸上皮細胞是一層動態(tài)的細胞層并作為腸腔內(nèi)容物和免疫系統(tǒng)之間的屏障。該屏障的功能是過濾一些促炎因子,如病原體、毒素和抗原。腸上皮細胞發(fā)揮這種功能依賴于腸道的緊密連接(TJ)和黏附連接(AJ)[18]。黏液層提供了抵御物理和化學(xué)損傷以及腸道病原體入侵的第一道防線。MUC2是防止病原微生物到達黏膜層的基礎(chǔ)[19]。Smirnov等[20]研究表明益生菌處理顯著增加肉雞腸道中的MUC2mRNA表達。Peng等[21]報道B.subtilisCW14通過提高ZO1蛋白表達從而減輕緊密連接損傷。Gadde等[22]研究表明益生菌組促使肉仔雞回腸的OCLN、ZO1mRNA表達升高。本試驗結(jié)果顯示,添加高劑量益生菌能顯著增加回腸ZO1和OCLNmRNA表達水平及盲腸黏膜中ZO1和CLDN1mRNA表達水平。與低劑量組相比,飼喂高劑量益生菌可顯著上調(diào)十二指腸、回腸和盲腸上皮中ZO1的基因表達。這也提示高劑量益生菌添加對肉雞腸道屏障的作用要優(yōu)于低劑量益生菌。本試驗結(jié)果顯示,添加復(fù)合益生菌可上調(diào)小腸上皮緊密連接相關(guān)基因的表達,提高腸絨毛高度,提示其潛在地促進腸道功能及生長性能的作用。

在門水平上,肉雞腸道優(yōu)勢菌主要是擬桿菌門和厚壁菌門。在健康的腸道環(huán)境中,優(yōu)勢菌群起主導(dǎo)作用,并且能抵抗外來細菌的定殖。本試驗結(jié)果顯示低劑量益生菌處理顯著增加了Sellimonas和Intestini-monas屬的豐度。Intestinimonas是一種產(chǎn)短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)的細菌[23],且SCFA對維持腸道健康具有重要作用,如作為營養(yǎng)素和能量源來保護腸黏膜[24]。LP組中Sellimonas屬水平也顯著增加,但Sellimonas的功能尚未見報道[25]。在本試驗中,Eisenbergiella的豐度在LP組中顯著下降,雖然該屬的生物學(xué)功能信息非常有限,但是Eisenbergiella屬于Lachnospiraceae,有研究表明Lachnospiraceae的增加可能與代謝性疾病如糖尿病的發(fā)生有關(guān)[26],這提示Eisenbergiella豐度的下降可能對機體有益。Akkermansiaceae為疣微菌門的第Ⅱ科(Family Ⅱ. Akkermansiaceae fam. nov.),Akkermansia是科內(nèi)唯一菌屬[27]。研究表明A.muciniphila的豐度與小鼠和人類肥胖以及Ⅱ型糖尿病等的發(fā)病率呈負相關(guān)[28]。腸道炎癥疾病患者的A.muciniphila豐度顯著低于普通人。Vemuri等[29]報道嗜酸乳桿菌DDS-1處理增加有益細菌如Akkermansiaspp.的豐度,我們的結(jié)果與之一致。A.muciniphila定殖在黏液層[30],本試驗中MUC2mRNA表達的增加與盲腸中Akkermansiaceae豐度的增加相一致。Intestinimonas和Akkermansiaceae豐度的增加以及Eisenbergiella豐度的減少意味著益生菌可能改變盲腸微生物菌群的組成,益生菌處理可能會增加有益細菌的定殖并減少有害細菌的定殖。我們使用Observed_species、Shannon、Simpson、Chao1、ACE、goods_coverage和PD_whole_tree來測量樣本中微生物的豐度和多樣性,盡管這些指標(biāo)沒有顯著差異,但在高劑量益生菌處理組其數(shù)值都升高,提示飼喂益生菌有增加腸道菌群多樣性的潛在作用。

早期添加復(fù)合益生菌可以增加肉仔雞盲腸內(nèi)有益菌的定殖并減少有害菌的定殖,改善雛雞腸道結(jié)構(gòu)并促進小腸發(fā)育,增強腸道間的緊密連接,改善早期生長性能并對后期生長具有潛在的益處,且添加高劑量益生菌的效果要優(yōu)于低劑量。因此,復(fù)合益生菌有望成為無抗養(yǎng)殖中綠色、安全的添加劑。