郭小雷

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院急癥部，天津 300381）

糖尿病腎?。―KD）是由糖尿病引起的最嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是終末期腎病最常見的病因，其中足細(xì)胞病變是DKD的主要病理表現(xiàn)之一。足細(xì)胞是腎小球臟層上皮細(xì)胞，對(duì)維持腎小球的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、濾過屏障的正常功能具有重要作用[1]。病理情況下足細(xì)胞損傷后出現(xiàn)上皮向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT），獲得分泌功能，促使細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，最終引起腎小球硬化及纖維化[2]。而減輕足細(xì)胞損傷能可延緩DKD進(jìn)展[3]。

miRNAs是一類長(zhǎng)度約18～22 bp的非編碼小分子RNA，在糖尿病及DKD的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用。其中miR-29b與腎纖維化相關(guān)，其在鹽敏感小鼠、單側(cè)輸尿管梗阻小鼠及鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的腎臟中均表達(dá)下降[4]。降低的miR-29b無法抑制膠原基質(zhì)的形成，導(dǎo)致腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。

糖尿病腎病在中醫(yī)屬于“消渴病腎病”范疇。黃連是傳統(tǒng)的清熱類中藥，在治療消渴的方劑中多有使用，魏晉時(shí)的《名醫(yī)別錄》就有“黃連止消渴”的記載[5]。黃連素是由中藥黃連等中提取出的生物堿，循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，黃連素通過降低血糖、膽固醇、C-反應(yīng)蛋白的作用，不但降低血液黏稠度，從血流動(dòng)力學(xué)方面改善腎小球的濾過能力，還可以減少對(duì)血管包括微血管的損害，治療糖尿病腎病，降低尿蛋白[6]。前期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，重用黃連的方劑對(duì)DKD有較好療效。但黃連素對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用，特別是保護(hù)足細(xì)胞免于EMT轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究較少，且這種保護(hù)作用是否由miR-29b介導(dǎo)也不清楚。因此，本研究擬將腎小球足細(xì)胞損傷與miR-29b相聯(lián)系，探討黃連素對(duì)足細(xì)胞損傷的作用，為臨床采用黃連素治療DKD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 黃連素、二亞基化砜（DMSO）、干擾素-γ（IFN-γ）、重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）購自Sigma公司，青鏈霉素雙抗混合液、0．25%胰蛋白酶購自Solarbio公司，RPMI 1640購自Hyclon公司，胎牛血清、Opti-MEM Reduced Serum Medium購自Gibco 公司：Trizol、miScript Reverse Transcriptase Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、Lipofectane 2000 購自Qiagen公司。限制性內(nèi)切酶、雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒（Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit）購自美國(guó)Promega公司；RIPA裂解液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液等購自博士德公司；PVDF膜購自Millipore公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA，MA5-11547）和肌間線蛋白（desmin，MA5-16357）單抗、podocin（PA5-37284）多抗購自 Thermo Fisher Scientific公司。ELISA試劑盒購購自德國(guó)IBL公司。

所用儀器為Nikon光學(xué)顯微鏡、Bio-Tek 800酶標(biāo)儀、Bio-rad凝膠圖像分析系統(tǒng)、ABI 7500型熒光定量PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 足細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將凍存的MPC-5條件永生化小鼠足細(xì)胞復(fù)蘇，在含有10 U/mL IFN-γ、10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中，33℃、5% CO2培養(yǎng)箱傳代。傳代后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)用無IFN-γ的培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14 d使細(xì)胞分化。

1.2.2 黃連素對(duì)MPC-5細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h使細(xì)胞同步。將細(xì)胞分為正常組（Control，5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（HG，30 mmol/L葡萄糖）和高糖+50 μmol/L 黃連素組（HG+Ber）。正常組常規(guī)培養(yǎng)；其余各組使用相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定培養(yǎng)液上清液中的TGF-β1；收集細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）法測(cè)定miR-29b表達(dá)；Western blot法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白 α-SMA、desmin、podocin的表達(dá)。

RT-qPCR法：收集各組細(xì)胞，提取總RNA后測(cè)定純度和濃度，將5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA、引物、熒光染料等加入反應(yīng)體系中，依試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共 40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μL。引物由上海生工合成。引物序列：mmumiR-29b逆轉(zhuǎn)錄引物采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)，為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACACTGA-3'，RT-qPCR引物為5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCACCATTTGAAA-3'和5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'，內(nèi)參U6 snRNA引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。所有樣品重復(fù)檢測(cè) 3 次，2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-29b的相對(duì)表達(dá)量。

Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，RIPA提取液提取總蛋白，BCA法定量后，蛋白樣品進(jìn)行10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別與 α-SMA（1∶1 000）、desmin（1∶1 000）、podocin（1∶1 000）的一抗雜交，再經(jīng)與 HRP 標(biāo)記的二抗雜交、化學(xué)發(fā)光顯色等步驟，Bio-rad凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次，取均值分析，實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參照物。

1.2.3 miR-29b過表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)分化的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL，接種于12孔板。將細(xì)胞分為正常組（Control，5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（HG，30 mmol/L葡萄糖）、高糖+miR-29b mimic NC組（HG+mimic NC）和高糖+miR-29b mimic組（HG+mimic）。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至60%～70%融合后，更換無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。更換Opti-MEM培養(yǎng)基，在Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染miR-29bmimicNC或mimic，培養(yǎng)6 h。更換各組相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。取培養(yǎng)液上清液，ELISA法測(cè)定其中的TGF-β1；收集細(xì)胞，Westernblot法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白α-SMA、desmin、podocin的表達(dá)。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-29b與TGF-β1是否直接結(jié)合 將TGF-β1基因3’-UTR克隆至pGL3質(zhì)粒，構(gòu)建pGL3-TGF-β1野生型載體和突變型載體。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL，接種于 12孔板，于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至60%～70%融合后，更換無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。更換Opti-MEM培養(yǎng)基，在Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染pGL3-TGF-β1野生或突變型載體及miR-29b mimic，5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。依雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說明書處理細(xì)胞，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.5 下調(diào)miR-29b表達(dá)對(duì)黃連素抑制轉(zhuǎn)分化的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL，接種于12孔板。將細(xì)胞分為正常組（Control，5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（HG，30 mmol/L葡萄糖）、高糖+50μmol/L 黃連素組（HG+Ber）、高糖+50 μmol/L黃連素+miR-29b inhibitor NC組（HG+Ber+inhibitor NC）和高糖+50 μmol/L黃連素+miR-29b inhibitor（HG+Ber+inhibitor）組。于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至60%～70%融合后，更換無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。更換Opti-MEM培養(yǎng)基，在Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor NC或inhibitor，培養(yǎng)6 h。更換各組相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。取培養(yǎng)液上清液，ELISA法測(cè)定其中的TGF-β1；收集細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白α-SMA、desmin、podocin的表達(dá)。

2 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 24．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用 Dunnett’s T3 法，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃連素對(duì)MPC-5細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響 高糖培養(yǎng)48h后，高糖組miR-29b表達(dá)較正常組顯著降低；而高糖+黃連素組的miR-29b表達(dá)較高糖組明顯增加（P＜0．01）。高糖組培養(yǎng)液上清液中 TGF-β1 濃度較正常組上升，而高糖+黃連素組培養(yǎng)液上清液中TGF-β1 濃度較高糖組明顯下降（P＜0．01）。進(jìn)一步分析顯示，高糖組EMT相關(guān)蛋白α-SMA、desmin表達(dá)較正常組上升，podocin表達(dá)較正常組下降，而高糖+黃連素組α-SMA、desmin表達(dá)較高糖組下降，podocin 表達(dá)較高糖組上升（均 P＜0．01）。見圖 1。

3.2 miR-29b過表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)分化的影響 與正常組相比，高糖組、高糖+miR-29b mimic NC組培養(yǎng)液上清液中TGF-β1濃度上升，而高糖+miR-29b mimic組的TGF-β1濃度較高糖組、高糖+miR-29b mimic NC 組明顯下降（P＜0．01）。與正常組相比，高糖組、高糖+miR-29b mimic NC組中α-SMA、desmin表達(dá)上升，podocin 表達(dá)下降（P＜0．01）。與高糖組和高糖+miR-29b mimic NC組相比，高糖+miR-29b mimic組α-SMA、desmin 表達(dá)下降，podocin 表達(dá)上升（P＜0．01）。見圖2。

圖1 黃連素對(duì)MPC-5細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響Fig.1 Effect of berberine on the transdifferentiation of MPC-5 cells

圖2 miR-29b過表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)分化的影響Fig.2 Effect of over expression of miR-29b on transdifferentiation

3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)測(cè)試miR-29b與TGF-β1是否直接結(jié)合 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pGL3-TGF-β1野生型質(zhì)粒時(shí)，熒光強(qiáng)度被明顯抑制，而轉(zhuǎn)染pGL3-TGF-β1突變質(zhì)粒時(shí)，熒光強(qiáng)度與正常水平接近，提示miR-29b可直接作用于TGF-β1并抑制其表達(dá)。

3.4 下調(diào)miR-29b表達(dá)對(duì)黃連素抑制轉(zhuǎn)分化的影響 為了探索miR-29b與黃連素在抗EMT作用之間的聯(lián)系，向MPC-5足細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-29b的inhibitor，并加入黃連素培養(yǎng)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，高糖組培養(yǎng)液上清液中TGF-β1濃度上升；與高糖組相比，高糖+黃連素組培養(yǎng)液上清液中TGF-β1濃度明顯下降；與高糖+黃連素組相比，高糖+黃連素+miR-29b inhibitor組培養(yǎng)液上清液中 TGF-β1 濃度明顯上升（P＜0．01）。

進(jìn)一步分析顯示，高糖組EMT相關(guān)蛋白α-SMA、desmin表達(dá)較正常組上升，podocin表達(dá)較正常組下降；而高糖+黃連素組α-SMA、desmin表達(dá)較高糖組下降，podocin 表達(dá)較高糖組上升（P＜0．01）。與高糖+黃連素組相比，高糖+黃連素+miR-29binhibitor組 α-SMA、desmin表達(dá)上升，podocin表達(dá)下降（P＜0．01）。見圖 3。

4 討論

足細(xì)胞是構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障的主要細(xì)胞之一，其覆蓋于腎小球基底膜表面，相鄰足細(xì)胞的足突相互交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可阻止大分子蛋白濾過。在糖尿病的病理?xiàng)l件下，足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，出現(xiàn)數(shù)量減少、足突融合、分泌功能改變等異常，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎小球基底膜增厚，最終導(dǎo)致蛋白尿和腎小球硬化[1]。

研究顯示，足細(xì)胞損傷是腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展至腎功能衰竭的主要原因。甚至在DKD早期，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞出現(xiàn)損傷。足細(xì)胞發(fā)生EMT是導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能紊亂及腎小球?yàn)V過屏障損害的重要原因。podocin是特異表達(dá)于足細(xì)胞上的一種跨膜蛋白，與其他蛋白組成蛋白復(fù)合體固定于細(xì)胞骨架上，對(duì)維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性及腎小球?yàn)V過功能具有重要作用，還具有離子通道和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能[7]。desmin是細(xì)胞骨架中間絲蛋白，正常情況下足細(xì)胞僅少量表達(dá)desmin；但足細(xì)胞損傷時(shí)其細(xì)胞骨架發(fā)生重排，導(dǎo)致大量表達(dá)desmin。因此，desmin是足細(xì)胞損傷的標(biāo)志蛋白[8]。α-SMA是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，正常情況下足細(xì)胞不表達(dá)α-SMA，但發(fā)生EMT時(shí)則大量表達(dá)α-SMA。α-SMA表達(dá)量的高低與腎間質(zhì)纖維化程度及腎病的進(jìn)展呈正相關(guān)[9]。

miR-29b在腎纖維化的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。2型糖尿病患者血漿中miR29b表達(dá)減少[10]。miR-29b的水平與IgA腎病的蛋白尿和腎功能相關(guān)[11]。高糖處理人上皮細(xì)胞系后，miR-29b表達(dá)減少，而膠原蛋白Ⅳ表達(dá)增加[12]。對(duì)鹽誘導(dǎo)的高血壓大鼠和Dahl鹽敏感大鼠的研究表明，miR-29b能調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞外基質(zhì)形成相關(guān)基因（如膠原基因，基質(zhì)金屬蛋白酶2和整合素β1）的表達(dá)，增高miR-29b能使腎髓質(zhì)免于纖維化[13]。鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟中miR-29b表達(dá)顯著降低[14]。

圖3 下調(diào)miR-29b表達(dá)對(duì)黃連素抑制轉(zhuǎn)分化的影響Fig.3 Effect of down regulation of miR-29b expression on inhibition of transdifferentiation by berberine

TGF-β1是促進(jìn)腎纖維化發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)胞因子[15]，既可以促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，又能通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解。研究顯示，miR-29b能負(fù)調(diào)控TGF-β1及其下游信號(hào)通路的活性，從而起到抑制細(xì)胞外基質(zhì)形成的作用。高糖條件下，TGF-β1能降低miR-29b在腎小管上皮細(xì)胞和足細(xì)胞中的表達(dá)，并增加膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的表達(dá)[16]。用TGF-β1處理的近端腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和足細(xì)胞中，miR-29b水平降低，而細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成增加。用miR-29啟動(dòng)子抑制劑處理的腎細(xì)胞系，纖維化標(biāo)志物表達(dá)增加[16]。本研究結(jié)果顯示，高糖處理使足細(xì)胞表達(dá)miR-29b減少，同時(shí)培養(yǎng)液上清液中TGF-β1濃度上升；轉(zhuǎn)染miR-29bmimic后，培養(yǎng)液上清液中TGF-β1濃度下降。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-29b可與TGF-β1啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制TGF-β1的表達(dá)。高糖處理還使足細(xì)胞表達(dá)EMT相關(guān)蛋白α-SMA、desmin表達(dá)上升，podocin表達(dá)下降；轉(zhuǎn)染miR-29b mimic后，可見α-SMA、desmin表達(dá)下降，podocin表達(dá)上升。提示過表達(dá)miR-29b可以減少TGF-β1水平，并降低足細(xì)胞EMT程度。

黃連素是一種生物堿，多種中藥如黃連、黃柏中均含有黃連素。以往研究證實(shí)，黃連素對(duì)糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、過氧化損傷、炎癥等諸多能引起DKD的病理機(jī)制，均有調(diào)節(jié)作用[17-18]，因此對(duì)DKD有較好療效。黃連素能降低DKD患者空腹血糖、糖化血紅蛋白及尿微量白蛋白排泄率[19]。黃連素能明顯降低2型糖尿病大鼠的血糖、血肌酐和24 h尿蛋白量[20]。黃連素能抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖與肥大、改善腎小球纖維化，其起效機(jī)制與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程[21]，抑制鞘氨醇激酶-1-磷酸鞘氨醇（SphK/S1P）通路活性[22]，抑制激活蛋白 1（AP-1）活化[23]，抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）及其下游靶基因轉(zhuǎn)錄[24]等相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，黃連素可減輕高糖處理對(duì)足細(xì)胞的不良影響，使miR-29b表達(dá)升高，TGF-β1水平降低，EMT相關(guān)蛋白α-SMA、desmin表達(dá)下降，podocin表達(dá)上升。轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor后，黃連素抑制足細(xì)胞EMT的作用減弱，表現(xiàn)為TGF-β1濃度上升；α-SMA、desmin表達(dá)上升，podocin表達(dá)下降。提示黃連素抑制足細(xì)胞EMT的作用需經(jīng)miR-29b介導(dǎo)。

綜上所述，黃連素可以通過調(diào)節(jié)miR-29b水平，進(jìn)而降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞表達(dá)TGF-β1、降低足細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的程度，從而在改善DKD癥狀方面發(fā)揮作用。