周雅然 ，張雪竹 ，沈鵬

（1．天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸部，天津 300381；2．國家中醫(yī)臨床醫(yī)學研究中心，天津 300381；3．天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300381；4．天津醫(yī)學高等?？茖W校，天津 300222）

阿爾茨海默?。ˋD）是臨床常見的神經變性疾病，病因不清，與β-淀粉樣蛋白沉積（Aβ）、tau蛋白過度磷酸化、氧化應激損傷、金屬離子失調等病理機制有關[1]。

NLRC5是NOD樣受體（NLRs）家族成員之一，是新近發(fā)現的細胞內模式識別受體，分布廣泛，是調控機體的先天免疫和炎癥反應的關鍵分子[2]。研究顯示，NLRC5能負調控核轉錄因子（NF-κB）信號通路活性，通過自身寡聚化抑制NF-κB通路上的NF-κB 抑制蛋白激酶（IκK）復合物磷酸化，從而阻止NF-κB活化，達到抑制炎癥反應，維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用[3]。目前關于NLRC5的研究，多集中于對機體外周免疫反應的調節(jié)，尚無NLRC5參與調節(jié)AD腦內神經炎癥反應的報道。

“調神益智”針法為石學敏院士根據癡呆患者腎精虧虛，腦髓失養(yǎng)的病機所創(chuàng)立，臨床應用該針法能顯著改善血管性癡呆患者的認知功能及日常生活能力[4]。該針法對AD模型動物的學習記憶能力也具改善作用[5]，且能減輕AD腦內星形膠質細胞活化增殖[6]。活化的星形膠質細胞不僅促進Aβ沉積，還能分泌多種炎癥因子和趨化因子形成正反饋級聯效應，加劇AD腦內炎癥反應[7]。

但目前關于針刺調控AD或快速老化小鼠（SAMP8）腦內炎癥的研究較少，也未見與NLRC5相關的研究報道。因此，本研究以SAMP8小鼠及其正常同源抗快速老化小鼠R1（SAMRl）作為對照，通過觀察針刺調控NLRC5對NF-κB通路的影響，從神經炎癥角度揭示針刺治療AD的部分機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒、Superscript first strand synthesis system購自Invitrogen公司；SYBR Green real time PCR Master Mix購自TOYOBO公司；DL2000 DNA ladder購自北京天為時代公司；Rnase A（核糖核酸酶A，R-4875）購自Sigma公司；小鼠來源的 NF-кB p65、NLRC5及 HRP標記的Actin單克隆抗體、Western Blotting化學發(fā)光試劑購自Santa Cruz公司；兔來源的Phospho-NF-κB p65（Ser536）（93H1）購自 CST 公司。白介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒購自德國IBL公司。

熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Light Cycler 480，Roche，德國）、酶標儀（Elx800，Bio-Tek，美國）、凝膠成像系統（ChemiDox XRS，Bio-Rad，美國）、凝膠成像分析軟件（Quantity One，Bio-Rad，美國）。

1.2 動物造模與分組 選取健康7月齡雄性SAMP8及其同源正常對照小鼠SAMR1，分為SAMR1組、SAMP8組和SAMP8針刺組，每組10只。動物飼養(yǎng)溫度（23±2）℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境中，自動控制光照循環(huán)12 h光照/12 h黑暗，每周更換鼠籠墊料1次。自由取食和飲水。動物由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供（津實動質M準字第006號，清潔級）。

1.3 治療方法 針刺組采用“調神益智”針法進行治療，取穴為水溝、內關和三陰交。穴位定位參照中國針灸學會實驗針灸研究會制定的《動物針灸穴位圖譜》。水溝行雀啄手法10次；內關行捻轉瀉法30 s；三陰交行捻轉補法30 s。每日治療1次，持續(xù)30 d，第7天休息1次。

1.4 Morris水迷宮評價認知功能 采用Morris水迷宮評價動物認知功能，具體方法參考文獻[8]。簡述如下，Morris水迷宮由圓形水池、圓柱形平臺和記錄系統3部分組成。水池直徑90 cm，高50 cm，池壁及池底涂成黑色。水池注水30 cm，水溫為（24±1）℃。隨意將水池分為4個象限；將無色透明的平臺（直徑9 cm，高28 cm）置于任一象限中央，平臺表面沒于水下1 cm。攝像頭置于水池中央的上方約2 m處，采集動物游泳軌跡圖像，由圖像自動采集和分析系統進行分析處理。

隱蔽平臺實驗：將平臺置于第3象限中央，平臺中點距池壁22．5 cm，且位置保持不變。將動物面朝池壁輕輕放入水中，記錄小鼠從入水至找到平臺的游泳軌跡及時間（逃避潛伏期）等。實驗前1 d，讓動物在迷宮中自由游泳以熟悉環(huán)境，上下午各1次，每次時間為60 s。如果60 s內找不到平臺，由實驗者將小鼠放到平臺上10 s以熟悉環(huán)境。正式實驗過程中，小鼠如果在60 s內找不到平臺也將其放在平臺上10 s，并將潛伏期記為60 s。此實驗于第1～5天進行，上下午各兩次，且入水點隨機改變，但同1天內上下午入水點的次序相同。

空間探索實驗：此實驗于隱蔽實驗結束后，撤除平臺立即進行。入水點選取第2象限，游泳時間為60 s，記錄小鼠在原平臺處停留時間以及穿越次數等。

反向實驗：將平臺置于第1象限中央，平臺中點距池壁22．5 cm，其他條件及方法同隱蔽平臺實驗。此實驗于第6～8天進行。

可視平臺實驗：為排除感覺、視覺或運動功能障礙對空間學習記憶的影響，第9天進行可視平臺實驗。此時平臺高出水面1 cm，并將平臺表面包裹成綠色，其余操作同隱蔽平臺實驗，上下午各1次。

1.5 RT-PCR法測定NF-κBmRNA等的表達 Trizol法提取海馬組織中總RNA。將2 μg總RNA逆轉錄為cDNA。將cDNA加入到含有上下游引物、熒光染料SYBR green的25 μL反應體系中，qRT-PCR法檢測其中p65、NLRC5基因相對于管家基因GAPDH的表達情況。引物由上海生工合成，引物序列為：P65，5’-CACCTCAATGGCTACACAGGACCA-3’，5’-ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT-3’；NLRC5，5’-CCTGAACGATGACAGCCTGA，5’-AACAGCATGGCTTAGGGACC-3’；GAPDH，5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，5’-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3’。PCR擴增條件為：95 ℃預變性 15 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，40 個循環(huán)。反應結束，2-ΔΔCT法分析結果。所有實驗重復3次。

1.6 Western Blot測定蛋白表達 RIPA裂解液提取海馬組織總蛋白。蛋白樣品經10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉印、5%脫脂奶封閉后，分別與總p65（t-p65）、磷酸化 p65（p-p65）、NLRC5（1∶1 000）一抗4℃雜交過夜，后與相應二抗雜交、化學發(fā)光顯色，采用凝膠圖像分析系統分析光密度值。每個樣品重復測量 3次，取均值分析。實驗以 β-actin（1∶1 000）作為內參照物。

1.7 ELISA 法檢測 IL-1β、IL-6、TNF-α水平 治療結束后，將動物處死，分離動物腦內海馬組織。依照ELISA試劑盒說明書，于450nm測定其中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 23．0統計軟件進行分析。所有數據均行正態(tài)性及方差齊性檢驗，結果以均數±標準差（±s）表示，隱蔽平臺和反向平臺實驗的逃避潛伏期比較采用重復測量方差分析，其他數據組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用 LSD-t檢驗（方差齊時）/Dunnett’s T3法（方差不齊時），P＜0．05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 針刺對認知功能的影響 對隱蔽平臺實驗的研究表明，SAMR1組的逃避潛伏期隨訓練天數增加逐漸降低；SAMP8組的逃避潛伏期雖隨時間降低，但明顯高于 SAMR1 組（P＜0．01）；針刺組的逃避潛伏期從第 3天起明顯低于 SAMP8 組（P＜0．05），但仍高于SAMR1對照組，見表1。從采用的搜索策略比較，第1天各組動物大多以邊緣式搜索策略尋找水中平臺，少數SAMR1小鼠能以隨機式策略發(fā)現平臺。第3天SAMR1和針刺組多能以趨向式策略找到平臺，而SAMP8組的動物中僅部分能以趨向式策略找到平臺，其余則多采取邊緣式或隨機式策略搜索平臺。第5天SAMR1組和針刺組小鼠多在相對較短時間內以趨向式找到平臺，部分表現為直線式；而SAMP8組則仍多以隨機式和趨向式策略尋找平臺，見圖1。

對空間探索實驗的研究表明，與SAMR1組比較，SAMP8組的首次穿越原平臺時間明顯較長，穿越原平臺次數較少，中環(huán)區(qū)域停留時間百分比較?。≒＜0．05），說明 SAMP8 的記憶保持能力受損。與SAMP8組比較，針刺組首次穿越原平臺時間較短，原平臺位置的穿越次數較多，中環(huán)區(qū)域停留時間百分比較高（P＜0．05），提示針刺能提高小鼠的記憶保持能力，見表2。對反向平臺實驗的研究表明，SAMP8組逃避潛伏期明顯高于 SAMR1 組（P＜0．05），提示SAMP8存在再學習能力的損傷。針刺組逃避潛伏期明顯短于 SAMP8 組（P＜0．05），而與 SAMR1 組差異無統計學意義（P＞0．05），提示針刺能提高 SAMP8 的再學習能力，見表3。對可視平臺實驗的研究表明，各組的逃避潛伏期和搜索策略間均差異無統計學意義（P＞0．05），提示感覺或運動功能的差異未對其空間學習記憶產生影響。

表1 隱蔽平臺實驗中逃避潛伏期結果比較（±s）Tab.1 Comparison of escape latencies in the hidden platform trials（±s）s

表1 隱蔽平臺實驗中逃避潛伏期結果比較（±s）Tab.1 Comparison of escape latencies in the hidden platform trials（±s）s

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與 SAMP8 組比較，#P＜0．05。

組別 動物數 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天SAMR1 組 10 33．49±12．89 26．20± 5．76 19．17± 4．06 20．62± 5．74 17．48±11．05 SAMP8 組 10 42．87±11．49** 36．71±14．47** 37．76±14．49** 33．62± 6．80** 32．59± 6．76**針刺組 10 36．10± 9．24* 30．14±11．99* 27．17±13．15*# 29．39±12．04* 25．55±18．90*#

圖1 隱蔽平臺實驗中搜索策略的變化Fig.1 Changes in search strategy in the hidden platform trials

表2 空間探索實驗結果比較（±s）Tab.2Comparison of the results in the probe trial（±s）

表2 空間探索實驗結果比較（±s）Tab.2Comparison of the results in the probe trial（±s）

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0．05；與 SAMP8 組比較，#P＜0．05。

中環(huán)區(qū)域停留時間百分比（%）SAMR1 組 10 12．80± 9．22 4．16±1．07 49．11± 7．71 SAMP8 組 10 29．94±17．19* 1．62±0．58* 29．70± 5．44*針刺組 10 14．31± 9．05*# 3．31±1．14# 43．50±13．12#組別 動物數 首次穿越原平臺時間（s）原平臺穿越次數（次）

表3 反向平臺實驗中逃避潛伏期結果比較（±s）Tab.3 Comparison of escape latencies in the reversal trials（±s）s

表3 反向平臺實驗中逃避潛伏期結果比較（±s）Tab.3 Comparison of escape latencies in the reversal trials（±s）s

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0．05；與 SAMP8 組比較，#P＜0．05。

組別 動物數 第6天 第7天 第8天SAMR1 組 10 43．83± 9．34 28．33± 9．72 28．87±13．47 SAMP8 組 10 44．83±14．34 49．77±10．80* 33．49±10．76*針刺組 10 40．63±12．94 33．89±10．02# 29．13± 9．65#

2.2 針刺對腦內NF-κB、NLRC5 mRNA表達的影響 SAMP8海馬內p65 mRNA表達較SAMR1明顯增高，NLRC5 mRNA表達較SAMR1顯著降低（P＜0．01）；針刺治療能夠明顯抑制 p65 mRNA 水平，提高NLRC5 mRNA水平，與SAMP8相比差異有統計學意義（P＜0．05），見圖 2。

圖2 海馬內p65和NLRC5 mRNA的表達情況（±s）Fig.2 p65 and NLRC5 mRNA expression level in the hippocampus（±s）

2.3 針刺對NF-κB、NLRC5通路蛋白表達的影響 Western Blot結果表明，各組β-actin表達量差異無統計學意義，提示各組上樣量均等。SAMP8海馬內 t-p65、p-p65、p-IκK 表達較 SAMR1 升高，NLRC5較SAMR1降低，組間比較差異具有統計學意義（P＜0．05）。針刺治療后，針刺組 t-p65、p-p65、p-IκK表達明顯下調，NLRC5表達上調，與SAMP8比較差異具有統計學意義（P＜0．05）。見圖3。

圖3 NLRC5、NF-κB通路蛋白的表達情況Fig.3 Expression of NLRC5，NF-κB pathway proteins

2.4 針刺對海馬內 IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 SAMP8 海馬內 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平較SAMR1顯著增高（P＜0．05 或 P＜0．01）；針刺能夠降低上述炎癥因子水平，特別是IL-6降低明顯，與SAMP8相比，差異有統計學意義，并且明顯高于SAMR1（P＜0．05），見表 4。

表4 海馬內 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（±s）Tab.4 IL-1β，IL-6，TNF-α levels in the hippocampus（±s）pg/g

表4 海馬內 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（±s）Tab.4 IL-1β，IL-6，TNF-α levels in the hippocampus（±s）pg/g

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與 SAMP8 組比較，#P＜0．05。

組別 動物數 IL-1β IL-6 TNF-α SAMR1 組 10 54．18±22．61 296．85± 48．42 64．52±21．36 SAMP8 組 10 88．19±29．38*563．16±150．06**98．41±35．52*針刺組 10 78．29±26．43 469．09± 73．23*#76．66±24．80*

3 討論

AD是衰老相關疾病。隨著衰老，細胞內氧化應激水平增高而蛋白質錯誤折疊的修復能力下降，均導致蛋白質變性損傷增多，以致Aβ沉積增加。研究顯示，Aβ具有強烈的誘導DNA損傷和神經元凋亡的作用[9]，Aβ可激活小膠質細胞和星形膠質細胞，并促進其釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子。炎癥因子水平增高不僅加速了Aβ沉積[10]，還可持續(xù)激活NF-κB通路。NF-κB通路的活化可促進多種炎癥遞質的轉錄表達，由此造成AD腦內正反饋式的瀑布級聯效應，導致慢性持續(xù)性神經炎癥反應，引起AD漸進性神經損傷[11]。

NLRC5是調控機體的先天免疫和炎癥反應的關鍵分子。NLRC5能負調控NF-κB信號通路活性，通過自身寡聚化抑制NF-κB通路上的IкK復合物磷酸化，從而抑制NF-κB的核移位，從轉錄水平抑制NF-κB信號通路活性，達到抑制炎癥反應，維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用[12]。敲除NLRC5基因或減少其表達后，NF-κB 活性相應提高，且 TNF-α、IL-6 和 IL-1β等炎癥因子強烈表達[13]。最近的證據表明，NLRC5通過Toll樣受體（TLR）信號通路來負調節(jié)NF-κB的激活[14]。

臨床研究證實，針刺治療輕中度AD有一定效果，能改善患者的認知功能、日常生活活動能力、神經精神癥狀和總體功能，特別在日常生活活動能力、神經精神癥狀和總體功能方面優(yōu)于臨床常用西藥安理申，且安全性、耐受性良好[15]。但目前關于針刺調控AD腦內炎癥的研究較少，也未見與NLRC5相關的研究報道。有關血管性癡呆的研究表明，針刺可使大鼠海馬缺血區(qū)p65和IL-1β、TNF-α表達降低，阻滯活化的NF-кB進入細胞核，抑制NF-кB信號通路的傳導，減少炎性細胞因子的釋放，從而減輕神經細胞的損傷，發(fā)揮腦保護作用[16-17]。

石學敏院士根據AD腎精虧虛，腦髓失養(yǎng)的病機，創(chuàng)立“調神益智”針法。其中，水溝居于督脈，督脈為陽脈之海，主一身之陽，與腦關系密切，水溝為督脈與手足陽明經之交會穴，性善啟閉開竅，有開竅醒神之功，為調神之要穴；內關為心包經絡穴，可清心開竅；三陰交為足厥陰肝經、足太陰脾經、足少陰腎經之交會，有補腎滋陰生髓的功能。3穴合用，可達到補腎填精、調神益智的作用。本研究發(fā)現，與SAMR1組比較，SAMP8小鼠學習記憶功能受損，NF-κB 通路中 p-IκK、p-p65表達上升，而 NLRC5表達下降，提示SAMP8認知下降與腦內炎癥反應增強有一定相關性。針刺組的水迷宮成績明顯優(yōu)于SAMP8組，針刺能明顯下調NF-κB通路中p-IκK、p-p65的表達，而提高NLRC5表達。提示SAMP8鼠腦內存在NF-κB通路激活現象，針刺能通過提高NLRC5來抑制IκK激酶磷酸化，從而減弱NF-κB的活化，減少炎癥因子釋放，緩解SAMP8小鼠腦內的炎癥反應，從而保護神經細胞，改善SAMP8小鼠認知障礙。

4 小結

SAMP8鼠腦內存在炎癥反應激活現象，針刺能通過提高NLRC5來抑制NF-κB的活化，減少炎癥因子釋放，降低腦內炎癥反應，從而改善神經元存活微環(huán)境，進而改善SAMP8小鼠的認知障礙。