齊越 李熒 賈冬 楊彩瑜 房曉楠 李紀彤

[摘要] 目的 觀察癲癇清顆粒對AD小鼠模型BBB的影響。 方法 采用側(cè)腦室注射Aβ復制AD模型。選取80只小鼠按體重隨機分為假手術(shù)組，模型組，癲癇清顆粒12.48 g/kg組、6.24 g/kg組、3.12 g/kg組，鹽酸多奈哌齊組，BD1047（sigma-1受體抑制劑）1 mg/kg組，BD1047+癲癇清顆粒12.48 g/kg組，每組各10只。假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物;同時BD1047組和BD1047+癲癇清12.48 g/kg組，則按照1 mg/kg的劑量腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)給藥21 d。末次給藥后，Morris水迷宮檢測小鼠的學習記憶能力;HE法觀察腦組織病理學變化;硫黃素S染色檢測腦組織中Aβ表達水平;Western blotting法測定海馬和皮質(zhì)中Occludin、ZO-1、Cx43、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平。 結(jié)果 與模型組比較，BD1047+癲癇清顆粒12.48 g/kg組、癲癇清顆粒12.48 g/kg組、6.24 g/kg組及3.12 g/kg組及鹽酸多奈哌齊組小鼠穿臺次數(shù)、p-PI3K及p-AKT蛋白表達水平顯著增加，Aβ表達水平降低，occludin、ZO-1及Cx43表達水平均顯著升高，其余指標差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;各給藥組小鼠腦組織病理變化均得到不同程度改善。 結(jié)論 癲癇清顆?？杉せ顂igma-1受體，通過PI3K/AKT信號途徑，抑制Aβ表達，保護BBB完整性，改善AD學習記憶障礙。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默病;血腦屏障;Sigma-1受體;小鼠;連接蛋白

[中圖分類號] R969.4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）32-0034-06

[Abstract] Objective To observe the effect of Dianxianqing particles on brain blood barrier（BBB） model of mice with Alzheimer′s disease（AD）. Methods The AD model was replicated by lateral ventricular injection of amyloid β-protein （Aβ）. A total of 80 mice were randomly divided into the sham-operated group， the model group， the Dianxianqing particles 12.48 g/kg group， the Dianxianqing particles 6.24 g/kg group， the Dianxianqing particles 3.12 g/kg group， the donepezil hydrochloride group， the BD1047（sigma-1 receptor inhibitor） 1 mg/kg group and the BD1047+Dianxianqing particles 12.48 g/kg group according to their body weight， with 10 mice in each group. The mice in the sham-operated group and the model group were given distilled water and the corresponding drugs were gavaged in each administration group. Meanwhile， the BD1047 group and the BD1047+Dianxianqing particles 12.48 g/kg group were administered intraperitoneally at a dose of 1 mg/kg once daily for 21 days. After the final administration， the learning and memory ability of mice was detected by Morris water maze test. The pathological changes of brain tissues were observed by hematoxylin-eosin staining（HE） method. The expression level of Aβ in brain tissue was detected by thioflavin S staining. The expression levels of occludin， zonula occludens-1（ZO-1）， connexin 43 （Cx43）， phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）， p-PI3K， serine-threonine kinase （AKT） and p-AKT in hippocampus and cortex were determined by Western blotting. Results Compared with the model group， the number of platform crossings and the expression levels of p-PI3K and p-AKT significantly increased in the BD1047+Dianxianqing particles 12.48 g/kg group， the Dianxianqing particles 12.48 g/kg group， the Dianxianqing particles 6.24 g/kg group， the Dianxianqing particles 3.12 g/kg group and the donepezil hydrochloride group. Meanwhile， the expression level of Aβ decreased， and the expression levels of occludin， ZO-1 and Cx43 significantly increased. There were no statistically significant differences in the remaining indicators. The pathological changes in the brain tissues of mice were improved to different degrees in each administration group. Conclusion Dianxianqing particles can activate sigma-1 receptor， as well as inhibit Aβ expression and protect BBB integrity through PI3K/AKT signaling pathway， thus improving learning and memory impairment of mice with AD.

[Key words] Alzheimer′s disease; Blood brain barrier; Sigma-1 receptor; Mice; Connexin

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）為一種老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為學習記憶能力減退、認知功能障礙，并伴有神經(jīng)精神異常和行為障礙。AD病因復雜，細胞外淀粉樣蛋白（Amyloid，Aβ）沉積被認為是AD的主要病理學特征[1]，并與血腦屏障（Blood-brain barrier，BBB）破壞密切相關(guān)[2]。動物和臨床研究表明，BBB功能障礙是AD的病理結(jié)果，并會加速其疾病進展[3-4]。因此，阻止Aβ誘導的BBB破壞對于AD治療較為重要。

Sigma-1受體是一種伴侶蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)[5]。由于其功能復雜，故參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程，如AD、亨廷頓病、抑郁癥等[6]。最近的研究表明，Sigma-1受體表達的改變對BBB內(nèi)皮細胞的活力和遷移具有深遠的影響[7-8]。癲癇清顆粒為專利藥（專利號：ZL 2011 1 0069494），由郁金、菖蒲、柴胡、水蛭等多味中藥組成，具有豁痰息風、活血通絡(luò)、開竅益智的功效。前期研究表明，癲癇清顆?？赏ㄟ^抑制Aβ沉積和tau蛋白磷酸化，改善AD模型小鼠的學習記憶障礙[9]，但是否具有保護BBB完整性的作用則尚不清楚。因此，本實驗采用側(cè)腦室注射Aβ誘導AD模型以此考察癲癇清顆粒是否通過sigma-1抑制Aβ沉積調(diào)節(jié)BBB完整性，并探討其相關(guān)機制，為癲癇清顆粒的臨床應(yīng)用提供夯實的實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 儀器? 腦立體定位儀（成都泰盟科技公司，型號：DW-200）;微量進樣器（上海安亭微量進樣器廠，規(guī)格：10 μL）;Y迷宮（遼寧中醫(yī)康復中心）;Morris水迷宮（成都泰盟科技公司，型號：MT-200）。

1.1.2 藥物與試劑? 癲癇清顆粒（遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，批號20140110，規(guī)格：生藥含量為5.31 g生藥/g）;鹽酸多奈哌齊片[衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號140 606 A，規(guī)格：5 mg] ;BD1047（TOCRIS公司，貨號：138356-21-5）;淀粉樣蛋白（Aβ25-35，美國Sigma公司，貨號;A4559）;兔抗磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）多克隆抗體（批號：GR3245955-1）均購自美國Abcam公司，兔抗磷酸化PI3K（Phospho-phosphatidylinositol 3 kinase，p-PI3K）多克隆抗體（批號：bs-6417R），兔抗絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Protein kinase B，AKT）多克隆抗體（bs-10724R），兔抗磷酸化AKT（Phospho-protein kinase B，p-AKT）多克隆抗體（批號：bs-0876R），兔抗肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（bs-10966R）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗緊密連接蛋白（occludin）多克隆抗體（批號：L02141996）、兔抗胞質(zhì)附著蛋白-1（tight junction protein 1， ZO-1）多克隆抗體（批號：H09253419）、兔抗連接蛋白43（Connexin-43，Cx43）多克隆抗體（批號：I06142837）均購自沈陽萬類生物科技有限公司，硫磺素-S（美國Sigma公司，批號;MKCC1990），二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：120219200821）;其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.1.3 動物? SPF級健康ICR雄性小鼠80只，體重20～24 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXY（遼）2015-0001。所有受試動物均飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼養(yǎng)室溫度為20～23℃、相對濕度為50%～60%。本研究經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，實驗操作符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。

1.2 方法

1.2.1 AD模型制備? 參考文獻方法并加以改進[10]。小鼠給予350 mg/kg的水合氯醛麻醉后，固定予腦立體定位儀上，剪毛，常規(guī)碘伏酒精消毒，手術(shù)刀縱向切開頭部皮膚長約2 cm，以囟門為原點，向右移動1 mm，后移動0.5 mm，作為側(cè)腦室的體表投射點，微量進樣器垂直進針，深度為3 mm，緩慢注射3 μL老化的Aβ25-35（1 mg Aβ25-35溶解到940 μL生理鹽水中，37℃孵育120 h），彌散5 min。傷口消毒后，縫合，置于鼠籠中飼養(yǎng)，注意術(shù)后保暖。假手術(shù)組注射等體積無菌生理鹽水。在實驗造模及給藥過程中對大鼠進行一般狀況觀察，并對死亡情況進行記錄。

1.2.2 分組及給藥? 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為假手術(shù)組（n=10）和模型組（n=70）。模型組小鼠按“2.1”項下操作復制AD模型;假手術(shù)組小鼠麻醉后側(cè)腦室注射無菌生理鹽水，其余步驟同造模組（腹腔注射的均為生理鹽水）。造模過程中，無小鼠死亡，參考文獻的造模成功標準[10]，70只小鼠全部造模成功。將70只小鼠按體重隨機分為模型組、癲癇清顆粒高、中、低劑量組（12.48、6.24、3.12 g/kg，以生藥量計）、鹽酸多奈哌齊組（灌胃給藥1.3 g/kg）、sigma-1R抑制劑（BD1047，腹腔注射1 mg/kg）和癲癇清顆粒組（12.48 g/kg，以生藥量計）+BD1047組（腹腔注射1 mg/kg）。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，藥物用蒸餾水進行溶解稀釋，假手術(shù)組與模型組小鼠均給予灌胃相應(yīng)體積的蒸餾水;每日給藥1次，連續(xù)21 d，給藥體積為20 mL/kg。癲癇清顆粒組：按癲癇清顆粒臨床人用量每日24 g計，小鼠用量為24 g×0.0026（20 g小鼠與70 kg人的系數(shù)比）×50=3.12 g/kg（以生藥量計），為臨床等效量作為低劑量;2倍量（6.24 g/kg，以生藥量計），作為中劑量;4倍量（12.48 g/kg，以生藥量計）作為高劑量;鹽酸多奈哌齊組：按鹽酸多奈哌齊人用量10 mg計，小鼠用量為10 mg×0.0026（20 g小鼠與70 kg人的系數(shù)比）×50=1.3 mg/kg;BD1047組：小鼠用量為參考文獻用量[11]。

1.3 觀察指標

1.3.1 水迷宮實驗? Morris水迷宮為直徑80 cm、高33 cm的白色圓桶狀裝置。將水迷宮裝置分為四個等面積的扇形區(qū)域，分別記為第一至第四象限。平臺為俯視圓形，側(cè)視工形的白色金屬裝置。平臺位于第一象限扇形區(qū)域中間位置。桶內(nèi)裝水，水中混勻可食用白色素掩蓋平臺位置，保持水面高于平臺1 cm。第16天至第20天，為小鼠訓練時間，每天游泳兩次，間隔4 h。第21天為空間探索實驗，記錄小鼠穿越平臺的次數(shù)。

1.3.2 腦組織病理形態(tài)學觀察? 行為學實驗結(jié)束，每組隨機選取6只小鼠進行蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色。小鼠快速取腦后，將其固定于4%多聚甲醛中，浸泡24 h。石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水后制備切片（切片厚度為4 μm），進行HE染色，光學顯微鏡下觀察腦組織的病理形態(tài)學變化。

1.3.3 腦組織內(nèi)Aβ表達的測定? 4 μm厚的石蠟切片來源于“2.4”項下的小鼠腦組織切片。石蠟切片脫蠟至水，自來水沖洗;磷酸鹽（PBS）緩沖液沖洗2 次，每次5 min;切片置于3%過氧化氫中10 min以滅活內(nèi)原性酶;PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min;1%硫黃素-S乙醇溶液避光孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min，JEOA801D形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)計算各組陽性細胞平均光密度值。

1.3.4 腦組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、occludin、ZO-1及Cx43的測定? 每組隨機選取4只小鼠，在小鼠的腦組織中加入高效的裂解液后，勻漿，12 000 r/min（4°C）離心20 min，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度?？偟鞍诪?0 μg進行十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，再以恒流電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上（100 mA、2 h）。用5%的脫脂奶粉進行室溫封閉2 h后，加入PI3K（1∶500）、p-PI3K（1∶400）、AKT（1∶500）、p-AKT（1∶300）、Occludin（1∶300）、ZO-1（1∶200）、Cx43（1∶300）和β-actin（1∶1000）一抗，4°C孵育過夜，PBS洗膜，每次10 min，連續(xù)3次;加入二抗（1∶5000），室溫內(nèi)孵育2 h，PBS洗膜，每次10 min，連續(xù)3次。加入ECL發(fā)光液進行曝光，采用Image J V1.8.0.112圖像分析軟件進行灰度值分析，以目標蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x±s）表示，首先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性則采用LSD檢驗進行組間兩兩比較，若方差不齊性則采用Dunnett′s T3檢驗進行組間兩兩比較。若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察結(jié)果

造模后，假手術(shù)組小鼠飲食進水及活動度良好，精神狀態(tài)正常;模型組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、倦怠懶動、目光遲滯等情況。灌胃給藥后，各給藥組小鼠的精神狀況及活動度有所增加，而模型組小鼠一般情況無明顯變化。

2.2 水迷宮實驗結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠穿越平臺的次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組相比，癲癇清顆粒6.24、12.48 g/kg劑量組、鹽酸多奈哌齊組和BD1047+癲癇清12.48 g/kg組穿越平臺的次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，BD1047組穿越平臺次數(shù)無明顯差異（P>0.05）。見表1。

2.3 腦組織病理形態(tài)學觀察結(jié)果

假手術(shù)組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列有序，細胞核清晰，核仁明顯，胞漿著色均勻，未見壞死和炎癥細胞浸潤;模型組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，細胞間隙増寬，胞體形狀不規(guī)則，胞質(zhì)嗜酸性增強，核固縮明顯，可見不同程度的神經(jīng)元變性壞死;癲癇清顆粒高、中、低劑量組可見小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)呈現(xiàn)輕、中、重的變化;鹽酸多奈哌齊組可見小鼠腦組織神經(jīng)元細胞排列整齊，錐體細胞排列緊密;BD1047組可見小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，胞質(zhì)嗜酸性增強，胞核固縮、溶解、消失;BD1047+癲癇清12.48 g/kg組可見小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元與周圍組織的間隙減小，散在的神經(jīng)元減少，錐體細胞排列緊密，可見少量核固縮。見封三圖2。

2.4 各組小鼠Aβ表達結(jié)果

為了明確癲癇清顆粒對AD模型小鼠腦內(nèi)病理特征的影響，本實驗采用硫黃素S染色檢測Aβ在AD模型小鼠腦組織中的表達。結(jié)果顯示，在假手術(shù)組中未觀察到陽性染色的Aβ斑塊。與假手術(shù)組相比，模型組和BD1047組小鼠陽性染色的Aβ斑塊數(shù)量和面積均明顯增加（P<0.01）。與模型組相比，鹽酸多奈哌齊組、癲癇清顆粒6.24、12.48 g/kg劑量組及BD1047+癲癇清12.48g/kg組小鼠腦組織內(nèi)Aβ斑塊的陽性染色明顯減少（P<0.05，P<0.01）。見封三圖3、表2。

2.5 各組小鼠BBB中連接蛋白表達的結(jié)果

本實驗采用Western bolt法檢測皮質(zhì)和海馬部位連接蛋白的表達。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Occludin、Cx43及ZO-1的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組相比，癲癇清顆粒6.24、12.48 g/kg劑量組和鹽酸多奈哌齊組Occludin、Cx43及ZO-1的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組相比，BD1047組Occludin、Cx43及ZO-1的表達無顯著性差異（P>0.05）。與模型組相比，BD1047+癲癇清12.48 g/kg組皮質(zhì)部位Occludin、Cx43及ZO-1的表達顯著增加，但相比癲癇清顆粒12.48 g/kg劑量組略有減少。見圖1、表3。

2.6 各組小鼠腦組織中PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組皮質(zhì)和海馬部位的p-PI3K、p-AKT表達顯著降低（P<0.05），PI3K及AKT蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與模型組相比，癲癇清顆粒6.24、12.48 g/kg劑量組和鹽酸多奈哌齊組皮質(zhì)和海馬部位的p-PI3K、p-AKT表達明顯增加（P<0.05）。與模型組相比，癲癇清顆粒3.12 g/kg劑量組、BD1047組和BD1047+癲癇清12.48 g/kg組p-PI3K和p-Akt的表達無顯著性差異，但BD1047+癲癇清12.48 g/kg組PI3K和p-AKT的水平略有增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2、表4。

3 討論

AD雖然歷經(jīng)了上百年的研究，但發(fā)病機制仍不明確。目前為止，較為公認的“β淀粉樣蛋白級聯(lián)假說”認定Aβ為導致AD復雜病理事件的始動因素，是AD發(fā)生發(fā)展的核心，且與BBB完整性密切相關(guān)。在生理情況下，完整的BBB功能可以促進Aβ清除，阻止外周Aβ向腦內(nèi)轉(zhuǎn)移，避免Aβ的毒性聚集。但當BBB的滲透性升高時則會造成Aβ的清除減少、Aβ積累和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的增加。更為重要的是，增加的Aβ神經(jīng)毒性又進一步破壞BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、分子調(diào)控以及免疫應(yīng)答等，形成惡性循環(huán)，加劇BBB損害。因此，抑制Aβ沉積導致的BBB破壞，對于早期發(fā)現(xiàn)潛在的AD人群及對AD致病機制的深入研究均有重大意義。

BBB是由腦微血管內(nèi)皮細胞、緊密連接、星形膠質(zhì)細胞終足、周細胞和基底膜共同構(gòu)成的選擇透過性細胞屏障系統(tǒng)，主要包括閉合蛋白、連接蛋白（Cx43，ZO-1，occludin）等[12]。AD患者Cx43、ZO-1、Occludin表達減少，BBB通透性增加[13]，學習記憶能力下降;APP/PS1小鼠腦中ZO-1表達顯著降低，BBB發(fā)生損傷[14];Occludin敲除基因小鼠可表現(xiàn)出嚴重的BBB滲漏[15]。以上研究均說明，連接蛋白的表達與BBB功能有關(guān)，并影響學習記憶能力。Aβ主要在與認知活動密切相關(guān)的腦區(qū)富集，如大腦皮層和海馬等，且與BBB密切相關(guān)[16]，Aβ沉積增加，則BBB通透性增強。因此，本實驗參考Aβ斑塊密度最大的兩個區(qū)域，即皮質(zhì)、海馬部位，檢測BBB緊密連接蛋白的表達。鹽酸多奈哌齊具有改善AD模型小鼠行為學的作用，且可抑制Aβ沉積，廣泛應(yīng)用于AD的治療[17]。故本研究選用鹽酸多奈哌齊作為陽性對照藥。Sigma-1R是一類區(qū)別于G蛋白偶聯(lián)和離子型受體的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和相關(guān)的免疫和內(nèi)分泌組織中。本文的前期研究表明，sigma-1受體活化后可抑制Aβ沉積，降低BBB通透性，改善學習記憶障礙（數(shù)據(jù)未見報道），說明sigma-1受體與BBB密切相關(guān)。本研究在AD小鼠模型的基礎(chǔ)上給予sigma-1受體抑制劑BD1047發(fā)現(xiàn)，根據(jù)表3數(shù)據(jù)表示，與模型組相比，BD1047組皮質(zhì)、海馬部位Cx43、ZO-1、Occludin表達、Aβ沉積無明顯差異，而BD1047與癲癇清顆粒聯(lián)用后，與模型組相比，小鼠穿越平臺次數(shù)增加，皮質(zhì)、海馬部位Cx43、ZO-1、Occludin表達提高，Aβ沉積減少，說明癲癇清顆粒通過激活sigma-1受體抑制Aβ沉積，降低BBB通透性，改善AD模型小鼠學習記憶能力。

PI3K是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110所組成的異二聚體。AKT也叫蛋白激酶B，是PI3K的下游效應(yīng)分子。PI3K磷酸化使質(zhì)膜上生成第二信使，進而激活A(yù)KT蛋白中的蘇氨酸磷酸化位點。PI3K/Akt作為細胞內(nèi)信號傳導通路之一，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、衰老、凋亡等過程[18]。研究表明，激活PI3K/Akt信號通路后，可增加Occludin水平，降低BBB通透性[19]。在本研究中，根據(jù)表4結(jié)果顯示，與模型組相比，BD1047組小鼠的p-PI3K及p-AKT表達水平無明顯差異，BD1047與癲癇清顆粒聯(lián)用后，與模型組相比，p-PI3K及p-AKT表達增加，PI3K及AKT表達未見明顯變化。

綜上所述，癲癇清顆粒具有改善AD模型小鼠BBB損傷的作用，其機制可能與激活sigma-1受體、通過PI3K/Akt通路抑制Aβ沉積有關(guān)。

[參考文獻]

[1] Krauser DL，Muller N. Neuroinflammation，microglia and implications for anti-inflammatory treatment in Alzheimer's disease[J]. J Alzheimers Dis，2010，2010（1）：5429-5438.

[2] Parachikova A，Nichol KE，Cotman CW. Short-term exercise in aged Tg2576 mice alters neuroinflammation and improves cognition[J]. Neurobiol Dis，2008，30（1）：121-129.

[3] Langen UH，Ayloo S，Gu C. Development and cell biology of the blood-brain barrier[J]. Annual Rev Cell Dev Bi，2019，35（1）：591-613.

[4] Sagare AP，Bell RD，Zhao Z，et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice[J]. Nat Commun，2013，4（1）：193-215.

[5] Mori T，Hayashi T，Hayashi E，et al. Sigma-1 receptor chaperone at the ER-mitochondrion interface mediates the mitochondrion-ER-nucleus signaling for cellular survival[J]. PLos One，2013，8（10）：e76 941.

[6] Ryskamp D，Wu J，Geva M，et al. The sigma-1 receptor mediates the beneficial effects of pridopidine in a mouse model of Huntington disease[J]. Neurobio Dis，2017，97（Pt A）：46-59.

[7] Christ MG，Huesmann H，Nagel H，et al. Sigma-1 receptor activation induces autophagy and increases proteostasis capacity in vitro and in vivo[J]. Cells，2019，8（3）：211.

[8] Olivieri M，Amata E，Vinciguerra S，et al. Antiangiogenic effect of（±）-haloperidol metabolite Ⅱ valproate ester [（±）-MRJF22] in human microvascular retinal endothelial cells[J]. J Med Chem，2016，59（21）：9960-9966.

[9] 康凱. 癲癇清顆粒對阿爾茨海默病模型小鼠Tau蛋白磷酸化及Aβ產(chǎn)生的影響[D].沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學，2017.

[10] 黃寓，康凱，齊越，等. 癲癇清顆粒對 Aβ（25-35）所致阿爾茨海默病小鼠模型學習記憶的影響[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報，2016，18（7）：29-32.

[11] Liu DY ，Chi TY，Ji XF，et al. Sigma-1 receptor activation alleviates blood-brain barrier dysfunction in vascular dementia mice[J]. Exp Neurol，2018，308：90-99.

[12] Huang ZS，Wong LW，Su YX，et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of Alzheimer’s disease[J]. Front Neuroendocrin，2020，59：100 857.

[13] Chalbot S，Zrtterberg H，Blennow K，et al.Blood-cerebrospinal fluid barrier permeability in Alzheimer's disease[J]. J Alzheimers Dis，2011，25（3）：505-515.

[14] Xie YN，Yan LL，Zeng HT，et al. Fish oil protects the blood-brain barrier integrity in a mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Chin Med-UK，2020，15（10）：698-712.

[15] Zhong XQ，Luo CJ，Deng MZ，et al.Scutellarin-treated exosomes increase claudin 5，occludin and ZO1 expression in rat brain microvascular endothelial cells[J]. Exp Ther Med，2019，18（1）：33-40.

[16] 龍犇，李向?qū)帲瑥埥ㄆ?，?β淀粉樣蛋白斑塊的高分辨全腦三維定量研究[J].中國科學：生命科學，2019，49（2）：140-150.

[17] Qi Y，Ji XF，Chi TY，et al. Xanthoceraside attenuates amyloid β peptide1-42-induced memory impairments by reducing neuroinflammatory responses in mice[J]. Eur J Pharmacol，2018，820：18-30.

[18] 梁德鳳，周鑫才，吳蕓菲. 二甲雙胍調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路對高糖誘導牙周膜成纖維細胞凋亡的影響研究[J]. 口腔醫(yī)學研究，2020，36（12）：1103-1107.

[19] Wang W，Dentler W L，Borchardt RT，et al. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280（1）：434-440.

（收稿日期：2021-05-07）