段培強(qiáng), 潘方燕, 曾楊梅,陳紅偉,姜 波, 吳俊偉,

1. 西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460：2. 重慶布爾動(dòng)物藥業(yè)有限公司，重慶 榮昌 402460

伊維菌素[1-2]是一類高效、廣譜、低毒性的大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲(chóng)藥物，對(duì)體內(nèi)外寄生蟲(chóng)特別是線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物有良好的驅(qū)殺作用，深受廣大養(yǎng)殖戶的好評(píng)．但其存在較多的缺陷，如藥效時(shí)間短，需反復(fù)多次給藥，吸收不充分，生物利用度低等[3-4]．本研究旨在研發(fā)一種藥效時(shí)間更長(zhǎng)，吸收利用率更高，毒副作用更小的伊維菌素注射液，并為該藥物的生產(chǎn)使用提供相應(yīng)的理論數(shù)據(jù)．

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品

1%長(zhǎng)效伊維菌素注射液，重慶布爾動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格：100 mL∶1 g，批號(hào)：161225：1%普通伊維菌素注射液，重慶布爾動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格：100 mL∶1 g，批號(hào)：161218：伊維菌素對(duì)照品，含量為93.8%，批號(hào)：0190812，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所：甲醇(HPLC)：安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆阂译?HPLC)：安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

1.1.2 衍生化試劑

N-甲基咪唑、三氟乙酸酐：美國(guó)Sigma公司．

1.1.3 儀器設(shè)備

JE202型電子天平：TD4K型臺(tái)式低速離心機(jī)：UItiMate3000型高效液相色譜：色譜柱：AcclaimTM120 C18(5 μm 120 A 4.6 mm×250 mm)：D-37520型臺(tái)式高速離心機(jī)：DW-86L338型超低溫冷藏柜：XW-80A型渦旋混合儀器．

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

健康榮昌本地黑山羊12只，雌、雄各半，體質(zhì)量為(24.08±2.89) kg，正常飼養(yǎng)管理．以青綠牧草為主，精料為不添加抗寄生蟲(chóng)藥物和抗生素的全價(jià)飼料，自由飲水，試驗(yàn)前臨床觀察3 d．試驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行隨機(jī)分組，并采血檢查．確保所有試驗(yàn)用山羊的血液中不含有伊維菌素．

1.2 伊維菌素含量測(cè)定方法

用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定藥物的準(zhǔn)確含量，所得結(jié)果用于計(jì)算準(zhǔn)確的給藥量，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性．

1.2.1 色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm：流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶水=35∶53∶12：流速：1.0 mL/min：進(jìn)樣量：20 μL：柱溫：30 ℃

1.2.2 藥物稀釋

將1%伊維菌素注射液配置成0.2 mg/mL的質(zhì)量濃度．精密量取2 mL伊維菌素溶液，置100 mL容量瓶中，用色譜級(jí)無(wú)水甲醇定容，搖勻，再用0.22 μm的有機(jī)濾頭過(guò)濾即得．長(zhǎng)效和普通伊維菌素注射液分別配置3個(gè)批次．

1.3 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)方法

1.3.1 給藥及血樣采集

將12只山羊隨機(jī)分為A、B兩組，A為長(zhǎng)效伊維菌素注射液組(簡(jiǎn)稱：長(zhǎng)效組)，B為普通伊維菌素注射液組(簡(jiǎn)稱：普通組)．按0.2 mg/kg的劑量單次皮下給藥，給藥后1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，48 h，72 h，96 h，144 h，240 h，336 h，432 h，528 h頸靜脈采血，每次采血樣3 mL，放置在5 mL含肝素鈉的離心管中，混勻，3 000 r/min離心10 min，吸取上層清液，放置在-20 ℃冰箱內(nèi)，待用．

1.3.2 血漿樣品處理

往裝有0.5 mL血漿的離心管中加乙腈1 mL，渦旋30 s，然后14 000 r/min離心5 min，取上清液置于10 mL離心管中，并往其中加入乙酸乙酯4 mL，渦旋1 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液置于另一新的10 mL離心管中，再向殘?jiān)屑尤? mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并上清液，50 ℃氮?dú)獯蹈桑苌?/p>

1.3.3 衍生化

往試管中加衍生化試劑A (N-甲基咪唑∶乙腈=1∶1)100 μL，渦旋混勻30 s：再加衍生化試劑B(三氟乙酸酐∶乙腈=1∶2) 150 μL，渦旋混勻30 s，密封避光，室溫下放置15 min，再往其中加入750 μL甲醇，渦旋混合30 s，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，裝入2 mL棕色進(jìn)樣瓶中，供高效液相色譜(HPLC)測(cè)定．

1.3.4 色譜條件

流速：1.5 mL/min：進(jìn)樣量：20 μL：柱溫：35 ℃：熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)365 mm，發(fā)射波長(zhǎng)：475 mm：洗脫梯度見(jiàn)表1．

表1 洗脫梯度

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用伊維菌素對(duì)照品配置5 μg/mL和0.5 μg/mL的原液，再取一定量的原液加入到空白血漿中，使其質(zhì)量濃度為100 ng/mL，50 ng/mL，25 ng/mL，5 ng/mL，1 ng/mL，經(jīng)蛋白處理和衍生化后用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)，得出相應(yīng)數(shù)據(jù)．以峰面積的比值(S)對(duì)質(zhì)量濃度(C)作線性回歸，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)．相關(guān)系數(shù)(R)要求大于0.99．

1.4.2 精密度與準(zhǔn)確度測(cè)定

精密度用批內(nèi)和批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)來(lái)考察，RSD值應(yīng)小于15%．準(zhǔn)確度應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)．用伊維菌素對(duì)照品配置100 ng/mL，50 ng/mL，5 ng/mL共3個(gè)質(zhì)量濃度的樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度配置5份，配置方法與1.4.1相同．連續(xù)3 d測(cè)定3個(gè)不同批次的樣品即可．

1.4.3 提取回收率

用伊維菌素對(duì)照品配置100 ng/mL，50 ng/mL，5 ng/mL共3個(gè)質(zhì)量濃度樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度配置5份，配置方法與1.4.1相同．要求回收率大于70%．

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

藥時(shí)數(shù)據(jù)用3p97軟件處理．選擇出最適宜的藥物代謝動(dòng)力學(xué)模型．藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、血藥質(zhì)量濃度顯著性分析用SPSS軟件處理．

2 結(jié) 果

2.1 伊維菌素含量測(cè)定

長(zhǎng)效組的準(zhǔn)確含量為標(biāo)示量的101.73%，普通組的準(zhǔn)確含量為標(biāo)示量的109.54%，符合獸藥典的規(guī)定．測(cè)定峰面積結(jié)果見(jiàn)表2，色譜圖見(jiàn)圖1．

表2 HPLC法測(cè)定伊維菌素的峰面積

2.2 回收率、標(biāo)準(zhǔn)曲線及變異系數(shù)

伊維菌素在質(zhì)量濃度為1 ng/mL～100 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=4 475x+3 075(y為藥物峰面積，x為藥物質(zhì)量濃度)，相關(guān)系數(shù)r=0.999(圖2)．以100 ng/mL，50 ng/mL和5 ng/mL 3個(gè)添加質(zhì)量濃度測(cè)定血漿樣品中伊維菌素的回收率分別為95.79%±1.33%，92.8%±0.87%，76.72%±1.09%，批間變異系數(shù)分別為0.46%，0.56%，0.63%：批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.5%，0.35%，0.93%(表3)．本試驗(yàn)的色譜峰型尖銳，血漿中雜質(zhì)分離良好，無(wú)明顯的干擾峰(圖3)．

圖1 HPLC法測(cè)定伊維菌素的峰面積色譜圖

圖2 伊維菌素在山羊血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 回收率及變異系數(shù)

圖3 伊維菌素專屬性高效液相色譜圖

2.3 山羊體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征

不同時(shí)間血藥質(zhì)量濃度實(shí)測(cè)平均值見(jiàn)表4，相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5，相應(yīng)的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖4．

表4 山羊體內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的血藥質(zhì)量濃度

表4 A、B兩組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)值

圖4 A、B兩組的藥時(shí)曲線

3 結(jié) 語(yǔ)

分析A、B兩組的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)可知，改良處方及生產(chǎn)工藝的長(zhǎng)效伊維菌素注射液在山羊體內(nèi)吸收更充分、更完全，降低了毒副作用，延長(zhǎng)了半衰期．長(zhǎng)效組的達(dá)峰質(zhì)量濃度(Cmax)為10.981 9 ng/mL，達(dá)峰時(shí)間(Tpeak)為25.226 3 h，與普通組的Cmax值(8.722 8 ng/mL)和Tpeak值(22.107 3 h)相比較，長(zhǎng)效組藥物在體內(nèi)達(dá)峰時(shí)間更長(zhǎng)且質(zhì)量濃度更高，其安全性更佳，藥效更好．長(zhǎng)效組的AUC值為 2566.770 9(ng/mL)×h，比普通組的AUC值增加了1 517.415 1(ng/mL)×h，表明其分布更廣泛、更均勻，作用時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，起到緩釋長(zhǎng)效的作用．

分析其原因，可能是與長(zhǎng)效組藥物血漿蛋白結(jié)合率變高有關(guān)．藥物在體內(nèi)以結(jié)合型和游離型兩種狀態(tài)存在，僅游離型藥物分子易被分布代謝[5]．當(dāng)結(jié)合率變高，使得血管內(nèi)游離的藥物分子減少，藥物吸收更加完全，并且避免了藥物短時(shí)間，高質(zhì)量濃度地集聚在作用部位而出現(xiàn)毒副作用[6-7]．藥物在代謝過(guò)程中，結(jié)合型的藥物分子不能被機(jī)體所代謝[8-9]，且機(jī)體內(nèi)游離的藥物分子和結(jié)合型的藥物分子處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，藥物與血漿蛋白結(jié)合率變高，游離的藥物分子減少，故能有效地延長(zhǎng)藥物的代謝時(shí)間，達(dá)到長(zhǎng)效的目的．