趙培靜， 曹 丁#， 陳勉華， 張玲華， 明飛平， 梁倩怡， 夏楓耿

（1.廣州市微生物研究所有限公司，廣東廣州 510663；2.華南農業(yè)大學生命科學學院，廣東廣州 510642）

隨著羅非魚高密度集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，其發(fā)病率越來越高，其中鏈球菌病防治難度較大，對羅非魚養(yǎng)殖造成了重大威脅，己成為羅非魚養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的最主要制約因素（陳福艷等，2019）。該病傳播快，致死率高，鏈球菌病爆發(fā)往往與水質惡化、養(yǎng)殖密度過高等有關（劉忠強等，2016）。到目前為止，對控制鏈球菌引起的羅非魚鏈球菌病仍缺乏安全高效的藥物。

抗菌肽菌絲霉素是一種新型真菌源抗菌肽，可克服抗生素類藥物在羅非魚鏈球菌病防治中存在的缺陷，具有良好的研究前景（Ryuichiro等，2019）。體外抗菌活性試驗顯示，其對革蘭氏陽性菌肺炎鏈球菌有顯著的抑菌活性，而同時又能促進細胞的增殖，增強巨噬細胞的吞噬活性，刺激免疫應答，提高抗體水平，增強抗病能力（楊雅麟，2009）。

丁酸梭菌具有抑制腸道有害細菌和促進腸道有益菌群增殖的雙重作用，從而維持腸道的正常微生態(tài)平衡（Kanai等，2015）。臨床研究表明，丁酸梭菌能夠增強動物的免疫力，其發(fā)酵動物飼料能降低飼料中的抗營養(yǎng)因子，從而改善動物的生產性能和產品質量，減少抗生素用量，提高經濟效益（Liao等，2015）。

丁酸梭菌作為農業(yè)部批準使用的動物飼料添加劑益生菌株，可減少抗生素的使用所引起的抗藥性、二重感染等（張善亭等，2013）。本研究前期已將抗菌肽菌絲霉素序列克隆入表達載體pMTL82151中，并整合入丁酸梭菌，構建并篩選出一株能高水平分泌表達菌絲霉素的丁酸梭菌工程菌株，并對其發(fā)酵工藝和制劑制備進行了優(yōu)化研究。在此基礎上，本試驗對抗菌肽菌絲霉素分泌型丁酸梭菌制劑進行抑菌活性穩(wěn)定性和在羅非魚不同養(yǎng)殖時期防治鏈球菌病的應用技術進行研究，計劃將此丁酸梭菌作為抗生素的替代品，以實現(xiàn)腸道內定植、防病治病、提高羅非魚水產品品質的目的，以及提供無毒副作用、無耐藥性、無殘留、低成本、效果顯著的功能型微生物制劑。

1 材料與方法

1.1 供試菌 產菌絲霉素的丁酸梭菌工程菌株、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、豬鏈球菌由廣東省微生物種質資源庫保存。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，酵母浸膏 20 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，硫酸銨1.5 g/L，碳酸氫鈉1.5 g/L，一水合硫酸錳0.23g/L，七水合硫酸鎂0.24 g/L，氯化鈣0.02 g/L，初始pH為6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，豆餅粉提取液40 g/L，硫酸銨1 g/L，碳酸氫鈉1 g/L，玉米漿3 g/L，一水合硫酸錳0.2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，氯化鈣0.02 g/L，初始pH為6.5。抑菌活性檢測培養(yǎng)基：氯化鈉 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L ，葡萄糖 5 g/L，瓊脂粉 2 0 g/L，PH 為 7.0。酵母抽提物，胰蛋白胨：英國 Oxoid公司；瓊脂粉：廣州環(huán)凱生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器設備 厭氧培養(yǎng)箱，生化培養(yǎng)箱，DHZ-DA大容量全溫振蕩器，752N型紫外可見分光光度計，50、500、5000 L 不銹鋼發(fā)酵罐，壓力噴霧干燥機，顯微鏡，電子天平，pH計等。

1.4 丁酸梭菌的發(fā)酵培養(yǎng) 將實驗室保存的丁酸梭菌菌株轉接于種子培養(yǎng)基中，液體試管深層靜置培養(yǎng)，37℃厭氧靜置培養(yǎng)24 h，按照5%的接種量加入種子培養(yǎng)基于平底燒瓶中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。然后以8%的接種量接種于50 L發(fā)酵罐中，并經過500、5000 L發(fā)酵逐級擴大培養(yǎng)，至穩(wěn)定期后期結束培養(yǎng)，培養(yǎng)過程分別取樣檢測各種生理指標。

1.5 丁酸梭菌菌劑的制備 將一定比例的保護劑加入待干燥的丁酸梭菌發(fā)酵液中，采用壓力噴霧干燥塔。進風流量保持在40000 m3/h，高壓泵壓力為10～15 MPa。首先設置噴霧干燥器的進風溫度，然后開機預熱，當塔內進口溫度達到設定溫度時，開啟高壓泵和噴槍，將料液以一定的流速泵入噴霧塔中，以此來控制出風溫度。干粉儲存于旋風分離器下收集袋中，將干粉收集密封于室溫干燥陰涼處保存。

1.6 產菌絲霉素丁酸梭菌的抑菌活性測定 稱取1 g粉末溶解于9 mL pH 6.0的PBS緩沖液中，離心取上清，采用標準瓊脂孔穴擴散法，用不同的致病菌作為指示菌，加入固體檢測培養(yǎng)基中，制備效價平板，用2.7 mm直徑的打孔器打孔，每孔加樣品5 μL，以菌絲霉素標準樣作為對照，在合適的溫度條件下培養(yǎng)一定時間后，觀察抑菌圈的產生情況。

1.7 丁酸梭菌制劑的穩(wěn)態(tài)化研究 將丁酸梭菌噴霧干燥粉末制劑，分別添加適量的米糠、豆粕、沸石粉，使菌絲霉素分泌菌株芽孢數(shù)為108cfu/g，以輔美粉稀釋組作為對照，分為3組，每組3個平行，分別于室溫放置三個月、半年、一年，檢測丁酸梭菌活菌數(shù)和Plectasin含量。

1.8 菌體濃度的測定 高層半固體瓊脂試管計數(shù)法：用移液管取1 mL菌液加到 9 mL半固體瓊脂試管培養(yǎng)基中，振蕩攪勻，不要有氣泡，依次進行10倍梯度稀釋，稀釋管和計數(shù)管于同一管，每個稀釋度作3個平行，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，記錄生長活菌數(shù)。

1.9 菌絲霉素含量的測定 將丁酸梭菌制劑溶解于磷酸緩沖液中，取適量的離心上清并稀釋至合適的倍數(shù)，以濃度為300 μg/mL的菌絲霉素蛋白為標準品。然后加入5 mL考馬斯亮藍試劑，充分振蕩混合，5 min后于595 nm測定光吸收值。以1 mL雙蒸水及加5 mL考馬斯亮藍試劑作為空白對照。

1.10 丁酸梭菌菌劑對羅非魚鏈球菌病防治效果測定 試驗魚為陽江羅非魚良種基地自行繁育的吉富羅非魚幼魚，體重為3 g左右，選擇無病無傷、活力強的個體作為試驗用魚。試驗前在網(wǎng)箱中暫養(yǎng) 10 d，池塘水溫為（35±2）℃，自然光周期。 暫養(yǎng)期間用增氧機不間斷增氧，每天8：00和16：00各投喂浮性飼料1次（粗蛋白質為27%～30.0%、脂肪4%～5.5%），投喂量為體重的8%～10%。

本次試驗共分為7組，在2 m×2 m×1 m的網(wǎng)箱中進行，在同一水塘中搭建7個同等規(guī)格的網(wǎng)箱，水深為0.8 m，試驗間的平均水溫為35℃。對照組飼喂基礎日糧，試驗組使用菌劑為菌含量為5×108cfu/g的菌絲霉素分泌型丁酸梭菌菌劑，根據(jù)拌料的劑量進行分組，每噸分別加菌劑50、100、150、200、250、300 g， 預防性的每周 2 次拌料；在整個養(yǎng)殖期間均施用該菌劑，各組隨機分配，每組50尾，試驗期60 d。養(yǎng)殖期間若發(fā)現(xiàn)死魚及時撈出并解剖記錄，分析死亡原因，并記錄觀察羅非魚在試驗期的健康狀況。

2 結果與分析

2.1 丁酸梭菌分泌菌絲霉素的抑菌活性測定用標準瓊脂孔穴擴散法測丁酸梭菌工程菌分泌產物菌絲霉素的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)菌絲霉素對以下10個代表性致病菌均有抑菌活性。其中，對條件致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K12D31、綠膿桿菌、黃單胞菌、巨大芽孢桿菌、沙門氏菌有較強的抑菌活性，抑菌圈直徑為9～12 mm；對豬鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的殺菌效果次之，抑菌圈直徑為7～9 mm，且抑菌圈邊緣清晰，效果明顯；顯示出丁酸梭菌分泌的基因重組抗菌物質菌絲霉素具有較為廣譜的抗菌活性，對革蘭氏陽性菌或陰性菌均有較好的抗菌效果。抑菌效果如表1。

表1 菌絲霉素對致病菌的抑菌效果mm

2.2 丁酸梭菌制劑的穩(wěn)態(tài)化研究 從表2可看出，丁酸梭菌粉末制劑在室溫存放0～12個月，其菌絲霉素均沒有明顯下降，說明丁酸梭菌粉末制劑中抗菌肽成分可以在室溫條件下進行長時間的保存。丁酸梭菌制劑在室溫存放三個月，米糠組其活菌數(shù)沒有明顯下降，其他組略有下降，隨著保存時間的延長，各組均出現(xiàn)了不同程度的下降，其中米糠組活菌數(shù)下降較少，就保護效果來看，米糠對丁酸梭菌活菌數(shù)穩(wěn)定性最好，豆粕粉和沸石粉次之，輔美粉對照組活菌數(shù)下降最多，因此選擇米糠作為菌絲霉素菌株的緩釋保護劑載體，可在常溫保存一年。

表2 保存時間對丁酸梭菌制劑穩(wěn)定性的影響

2.3 丁酸梭菌制劑防治羅非魚鏈球菌病的使用劑量研究 由表3可以看出，隨著丁酸梭菌劑量的提高，發(fā)病率明顯下降，而 200、250、300 g/t添加組發(fā)病率接近，從成本考慮，丁酸梭菌添加量選用200 g/t添加組進行下一步試驗，即菌絲霉素菌劑 5×108cfu/g，每噸加菌劑 200 g。

表3 菌絲霉素菌劑不同劑量防治羅非魚鏈球菌病效果%

2.4 丁酸梭菌制劑防治羅非魚鏈球菌病的使用頻率研究 根據(jù)上步試驗，選用菌絲霉素分泌型丁酸梭菌復配菌劑5×108cfu/g，每噸加菌劑200 g，分別按照預防性的兩周一次拌料，每周一次、二次、三次、四次、五次拌料，分為6組，對照組飼喂基礎日糧，飼養(yǎng)方法同上。

從表4數(shù)據(jù)可看出，隨著加入丁酸梭菌制劑次數(shù)的增多，羅非魚鏈球菌病發(fā)病率有下降的趨勢，每周拌料2～3次以上，發(fā)病率接近，因此從經濟成本考慮，建議每周拌料2次。

由表3、4可知，隨著丁酸梭菌使用頻率的降低，預防效果在顯著下降，說明菌絲霉素菌劑可顯著預防鏈球菌感染。因此選用菌絲霉素菌劑5×108cfu/g，每噸拌200 g，預防性的每周2次拌料，可顯著降低羅非魚鏈球菌病發(fā)病率。

表4 菌絲霉素菌劑不同使用頻率防治羅非魚鏈球菌病效果%

2.5 丁酸梭菌制劑防治羅非魚鏈球菌病的使用階段研究 為進一步降低養(yǎng)殖成本，方便推廣應用，進一步明確是否要整個養(yǎng)殖期間均施用該菌劑，試驗選取羅非魚生長不同階段如幼苗期和成長期分別施用該菌劑，檢測其使用效果。

從表5可知，在羅非魚養(yǎng)殖的特定階段，在養(yǎng)殖飼料中添加丁酸梭菌均有降低鏈球菌病發(fā)病率的效果；其中，全程使用菌絲霉素菌劑效果最好，發(fā)病率最低，可降低發(fā)病率58.6%，而單獨在某個生長期使用，雖然有一定防效，但效果不如全程使用。

表5 不同養(yǎng)殖期間使用菌絲霉素菌劑防治羅非魚鏈球菌病效果%

3 結論與討論

本研究對抗菌肽菌絲霉素分泌型丁酸梭菌制劑進行了抑菌活性、穩(wěn)定性和羅非魚養(yǎng)殖應用研究，發(fā)現(xiàn)此表達產物抗菌肽對常見致病菌如大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和豬鏈球菌均有較好的抑菌活性，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌率為68.74%。選用米糠作為菌絲霉素分泌型丁酸梭菌的緩釋保護劑載體，此制劑可在常溫保存一年。通過上述的應用基礎試驗，初步建立一套菌絲霉素分泌型丁酸梭菌制劑養(yǎng)殖應用方案，用法用量為在羅非魚飼養(yǎng)全程，選用菌絲霉素菌劑5×108cfu/g，每噸的飼料拌料添加丁酸梭菌制劑200 g，預防性的每周2次拌料，可顯著降低羅非魚鏈球菌病發(fā)病率58.6%以上。

諸多研究證實丁酸梭菌制劑能調節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡，防治相關動物疾病，提高動物生產性能和產品質量，有效地減少抗生素引起的二重感染和動物體內的藥物殘留（易中華，2012），但目前丁酸梭菌制劑還未被普遍的作為益生菌劑添加于動物飼料。孫梅等（2011）采用微膠囊化包埋丁酸梭菌，顯著提高了丁酸梭菌作為飼料添加劑的使用效果，為丁酸梭菌的廣泛應用奠定了基礎。

羅非魚是主要的水產品出口品種，對我國的農業(yè)國際貿易極其重要，羅非魚鏈球菌病的爆發(fā)，漁農頻繁使用一些違禁藥物，對我國水產品的質量安全造成極大威脅（蘇友祿等，2019）。本研究開發(fā)的抗羅非魚鏈球菌病菌絲霉素分泌型丁酸梭菌劑，可實現(xiàn)在丁酸梭菌中高水平分泌表達菌絲霉素蛋白，將抗菌肽的廣譜抗菌作用和益生菌的保健功能結合起來，此協(xié)同作用有望克服單一微生態(tài)制劑存在的作用單一、質量不穩(wěn)定、成本高、殺菌效果不如抗生素等缺陷（田木，2015）。此制劑作為生物防治羅非魚鏈球菌病的高效活菌制劑，具有防治羅非魚鏈球菌病發(fā)生和促進羅非魚生長的作用，而且能大大降低化學藥物的使用量，同時對于減少養(yǎng)殖水體有害物質的積累和保證農產品的質量安全又具有積極的作用，因此本產品具有較好的推廣應用和市場化前景（李俊等，2019）。