張含樂， 解綬啟， 贠 彪， 錢雪橋*

（1.廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心，廣東廣州511400；2.中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430072）

近年來，由于魚粉價(jià)格的不斷攀升造成飼料成本高企，植物蛋白部分替代魚粉有益于降低飼料成本，現(xiàn)已成為水產(chǎn)飼料的研究熱點(diǎn)（尹娜等，2011）。玉米蛋白因蛋白質(zhì)含量高，不含抗?fàn)I養(yǎng)因子，已被作為良好的蛋白源應(yīng)用于水產(chǎn)飼料（華雪銘等，2011）。然而，當(dāng)玉米蛋白粉替代超過一定水平時(shí)，易導(dǎo)致適口性和營養(yǎng)物質(zhì)消化率降低，對腸道健康產(chǎn)生負(fù)面作用 （賈倩，2020；Bai等，2019；Obinson 等，2001）。

丁酸鈉有效成分為丁酸，是腸道微生物發(fā)酵形成的短鏈脂肪酸，能夠?yàn)槟c上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖修復(fù)，抑制腸道炎癥反應(yīng)，在維持腸穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用（Hamer等，2008）。在草魚（Ctenopharyngodon idellus）（唐建洲等，2020；Zhou 等，2019）、 大菱鲆 （Scophthalmus maximus L.）（Liu 等，2019； 魏朝青等，2017）、 鯽魚（Carassius auratus）（Sun 等，2013）、 尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）（Jesus等，2019）等魚類上的研究表明，飼料中添加丁酸鈉能促進(jìn)腸道組織結(jié)構(gòu)完整性，提升營養(yǎng)利用和生長性能，而丁酸鈉在黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）的應(yīng)用鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過在玉米蛋白粉替代魚粉的飼料中添加丁酸鈉，研究其對黃顙魚生長性能、飼料利用和腸道組織形態(tài)的影響，為黃顙魚低魚粉配合飼料的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。以魚粉、豬肉粉、雞肉粉和豆粕等為蛋白源，面粉為糖源，豆油為脂肪源，配制魚粉含量為30%的對照組飼料，并以玉米蛋白粉替代30%魚粉制成低魚粉飼料，然后在低魚粉飼料中分別添加0.1%、0.2%、0.4%和0.8%的丁酸鈉，共6 組試驗(yàn)飼料（D1、D2、D3、D4、D5、D6 組）。所有原料由珠海海龍生物科技有限公司提供，經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎后過80目篩，然后按照表1配方稱取各種飼料原料，采取逐級擴(kuò)大法混合均勻，再加入豆油揉搓混合均勻，最后將以上原料充分調(diào)質(zhì)后用雙螺桿膨化機(jī)制成粒徑為3 mm的膨化浮性飼料并烘干保存。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平%干重

1.2 試驗(yàn)管理 養(yǎng)殖試驗(yàn)在廣東海大集團(tuán)試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)用黃顙魚苗購于佛山當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶。將試驗(yàn)魚先暫養(yǎng)2周，期間飼喂基礎(chǔ)飼料。正式養(yǎng)殖試驗(yàn)前，將試驗(yàn)魚饑餓24 h，選擇2400尾健康無病、規(guī)格均一、平均體重為（100±0.15）g的黃顙魚隨機(jī)分到24個(gè)浮式網(wǎng)箱 （2 m×2 m×2 m），每個(gè)網(wǎng)箱100條魚。每種試驗(yàn)料喂4個(gè)網(wǎng)箱，每天飽食投喂兩次（06:00和18:00）。每天記錄每個(gè)網(wǎng)箱的投喂量、死魚數(shù)量和重量。養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為8周，期間水溫為21～30℃，溶氧水平大于7 mg/L。分魚當(dāng)天隨機(jī)取5條魚保存于-20℃，用于分析初始魚體組成。

1.3 樣品采集 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，所有魚饑餓24 h，然后稱量總重，并記錄每個(gè)網(wǎng)箱中魚的尾數(shù)。每個(gè)網(wǎng)箱取3尾魚保存于-20℃，用于分析魚體組成。每個(gè)網(wǎng)箱另取3尾魚，丁香酚麻醉后分別測定體重和體長，然后解剖取出內(nèi)臟團(tuán)和肝臟并稱重。取出腸道用0.86%生理鹽水沖洗內(nèi)容物，分別剪取0.5 cm前腸中間部分放入波恩氏液保存，用于組織切片制作觀察腸道結(jié)構(gòu)。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長指標(biāo)測定

增重率/%=（末體重-初體重）/初體重×100；

飼料系數(shù)=攝食總重/（末體重-初體重）；

攝食率/%=攝食總重/[（末體重+初體重）/2]/養(yǎng)殖天數(shù)×100；

成活率/%=試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚尾數(shù)/試驗(yàn)開始時(shí)魚尾數(shù)×100；

臟體比/%=試驗(yàn)魚內(nèi)臟重/試驗(yàn)魚體重×100；

肝體比/%=試驗(yàn)魚肝臟重/試驗(yàn)魚體重×100；

肥滿度/%=（試驗(yàn)魚體重/試驗(yàn)魚體長3）×100；

蛋白沉積率/%=（終末魚重×終末魚體蛋白含量-初始魚重量×初始魚體蛋白含量）/（攝食總量×飼料蛋白含量）×100；

脂肪沉積率/%=（終末魚重×終末魚體脂肪含量-初始魚重量×初始魚體脂肪含量）/（攝食總量×飼料脂肪含量）×100。

1.4.2 常規(guī)成分測定 本研究中常規(guī)成分包括飼料和魚體的水分、蛋白質(zhì)、脂肪。常規(guī)營養(yǎng)組成指標(biāo)的測定依據(jù)AOAC（1995）方法進(jìn)行，采用將樣品在105℃烘干至恒重的方法測定飼料和全魚水分含量；飼料和全魚粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮方法進(jìn)行測定 （2300-Auto-analyzer，F(xiàn)OSS，Hillero/d，Denmark）；飼料和全魚粗脂肪含量采用索式抽提法（36680-analyzer，BUCHI，F(xiàn)lawil，Switzerland）測定。

1.4.3 腸道組織結(jié)構(gòu)觀察 將固定液中的腸道組織取出，乙醇梯度脫水后用石蠟包埋，組織切片機(jī)切片，厚度為 7 μm，蘇木素和伊紅染色（HE染色），中性樹膠封片。光鏡下觀察，并拍照。之后使用Image-Pro Plus 6軟件對腸道切片照片進(jìn)行皺襞高度和肌層厚度的測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），當(dāng)組間差異顯著時(shí)用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 攝食和生長性能 由表2可知，采用玉米蛋白粉替代30%的魚粉后，黃顙魚的末體重、增重率和攝食率分別顯著下降16.1%、35.4%和12.1%（P＜0.05），在低魚粉飼料中添加0.2%的丁酸鈉后黃顙魚的末體重和增重率相對負(fù)對照D2組顯著提高了 7.8%和 22.2%（P＜0.05）；0.4%和0.8%添加組與0.2%添加組相比無顯著差異（P＞0.05）；添加不同水平丁酸鈉對攝食并無促進(jìn)作用（P＞0.05）；不同飼料處理對成活率無顯著影響（P＞0.05）。

表2 不同飼料對黃顙魚生長性能和攝食的影響

2.2 形體指標(biāo)和魚體營養(yǎng)組成 由表3可知，采用玉米蛋白粉替代30%魚粉后，魚體粗蛋白質(zhì)含量顯著下降6.1%（P＜0.05），低魚粉飼料中添加丁酸鈉對魚體粗蛋白質(zhì)含量無顯著影響 （P＞0.05）。不同組之間的肝體比、臟體比、肥滿度和粗脂肪沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表3 不同飼料對黃顙魚形體指標(biāo)和魚體組成的影響%

2.3 飼料利用 由表4可知，采用玉米蛋白粉替代30%的魚粉后黃顙魚的飼料系數(shù)顯著增加了21.7%，蛋白質(zhì)沉積率和脂肪沉積率顯著下降了27.1%和26.9%（P＜0.05）；在低魚粉飼料中添加0.2%丁酸鈉（D4組）后，黃顙魚蛋白質(zhì)沉積率相對負(fù)對照組（D2組）顯著提升了19.5%（P＜0.05），脂肪沉積率提升21.1%，飼料系數(shù)下降11.6%，但差異不顯著；低魚粉飼料中繼續(xù)增加丁酸鈉添加量到0.4%和0.8%與0.2%相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表4 不同飼料對黃顙魚營養(yǎng)利用的影響

2.4 腸道組織結(jié)構(gòu) 由表5可知，采用玉米蛋白粉替代30%的魚粉后，黃顙魚腸道皺襞高度和腸道肌層厚度顯著下降23.9%和21.6%（P＜0.05）；在低魚粉飼料中添加0.2%的丁酸鈉后黃顙魚腸道肌層厚度和皺襞高度顯著提高18.7%和13.4%（P＜0.05），其中肌層厚度達(dá)到和對照組無顯著差異水平（P ＞ 0.05）。

表5 不同飼料對黃顙魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響μm

3 討論

3.1 飼料中玉米蛋白粉替代魚粉后添加丁酸鈉對黃顙魚生長及飼料利用的影響 本試驗(yàn)中，玉米蛋白粉替代30%魚粉顯著降低了黃顙魚增重率、飼料系數(shù)和攝食率，蛋白質(zhì)沉積率和脂肪沉積率也顯著下降，這表明較高水平玉米蛋白粉替代會抑制攝食和降低營養(yǎng)物質(zhì)利用，從而降低黃顙魚的生長性能。相關(guān)研究表明，玉米蛋白粉替代30%魚粉后，異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）飼料系數(shù)顯著升高，蛋白質(zhì)效率顯著降低（華雪銘等，2012）；添加25%的玉米蛋白粉則顯著降低了卵形鯧鲹（Trachinotusovatus）的增重率、飼料系數(shù)、攝食率、蛋白質(zhì)效率、蛋白質(zhì)沉積率、脂肪沉積率（胡海濱等，2019）；在大菱鲆上的研究也表明，玉米蛋白粉替代34%魚粉會導(dǎo)致飼料系數(shù)顯著升高（賈倩，2020）。玉米蛋白粉替代飼料中魚粉導(dǎo)致黃顙魚攝食率降低，可能與魚粉中未知生長因子缺乏，以及適口性不佳有關(guān)。另一方面，玉米蛋白粉中的非淀粉多糖遇水易形成膠態(tài)溶液，難以被消化酶降解，降低對營養(yǎng)物質(zhì)的消化分解（盧崢等，1997），同時(shí)，玉米蛋白粉必需氨基酸缺乏，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成代謝IGF-I基因表達(dá)下調(diào)，蛋白質(zhì)沉積減少（Luo等，2013），這可能是本研究中黃顙魚蛋白質(zhì)和脂肪沉積率下降的主要原因。但也有研究報(bào)道，玉米蛋白粉替代35%魚粉不會對異育銀鯽 （陳然等，2019）、 軍曹魚（Rachycentron canadum）（駱?biāo)囄模?012）、 尖吻鱸 （Lates calcarifer）（Nandakumar 等 ，2017） 和 大 黃 魚 （Larimichthys crocea）（何嬌嬌等，2018）的攝食率、蛋白沉積率產(chǎn)生顯著影響。這可能與不同養(yǎng)殖品種對玉米蛋白粉的利用能力以及基礎(chǔ)飼料中魚粉的含量不同有關(guān)。

本試驗(yàn)中玉米蛋白粉替代魚粉后添加0.2%～0.8%丁酸鈉可顯著改善其生長性能、提高飼料利用率。丁酸鈉作為一種短鏈脂肪酸鹽，對草魚、大菱鲆、鯽魚、尼羅羅非魚等魚類有促生長作用已有報(bào)道 （唐建洲等，2020；Jesus 等，2019；Liu 等，2019；Zhou 等，2019； 魏朝青等，2017；Sun 等，2013）。丁酸鈉對于攝食低魚粉飼料魚類生長性能的提升作用也在大菱鲆（Liu等，2019）上有報(bào)道，其適宜添加量為0.2%。有研究表明，丁酸可促進(jìn)蛋白質(zhì)消化和礦物質(zhì)吸收，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率（Reda等，2016）；丁酸可為腸上皮細(xì)胞的再生和修復(fù)提供能量來源 （Becattini等，2016）；抑制MLCK信號途徑上調(diào)緊密連接蛋白基因表達(dá)，維持魚類腸道細(xì)胞間結(jié)構(gòu)完整性（田莉，2017）；促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖和分化，改善腸道吸收功能，增加必需氨基酸利用效率（Robles等，2013），這可能是本試驗(yàn)中0.2%～0.8%丁酸鈉添加組黃顙魚生長性能提升的主要原因。

3.2 飼料中玉米蛋白粉替代魚粉后添加丁酸鈉對黃顙魚體成分的影響 本試驗(yàn)玉米蛋白粉替代魚粉后黃顙魚魚體粗蛋白質(zhì)含量顯著降低，丁酸鈉添加后粗蛋白質(zhì)含量升高。有研究表明，高植物蛋白質(zhì)飼料替代50%魚粉添加0.15%～0.6%丁酸鈉未影響大菱鲆幼魚粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量（魏朝青等，2017）；0.15%丁酸鈉添加在豆粕替代40%魚粉飼料中，黃姑魚粗蛋白質(zhì)無顯著差異（Wu等，2020）；然而，在尼羅羅非魚飼料添加丁酸鈉可顯著提高全魚粗蛋白質(zhì)含量 （Ahmed等，2015）；隨著飼料中植物蛋白含量的上升，魚體干物質(zhì)含量下降（Harlioglu，2011），上述報(bào)道與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相似。丁酸鈉使黃顙魚魚體蛋白含量增加，可能與促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和分化，改善了腸道吸收功能有關(guān)（Canani等，2012），也可能是丁酸鈉可顯著提高腸道小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1的表達(dá)水平，促進(jìn)小肽消化吸收 （吳凡，2016；Liu等，2014），具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3 飼料中玉米蛋白粉替代魚粉后添加丁酸鈉對黃顙魚腸道組織形態(tài)的影響 本試驗(yàn)玉米替代魚粉后黃顙魚腸道肌層厚度和皺襞高度顯著降低，這與賈倩（2020）在大菱鲆上的研究結(jié)果一致。其可能原因是玉米蛋白粉中的玉米醇溶蛋白存在大量疏水性氨基酸，結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，降低了腸道對醇溶蛋白的吸收，其過程易導(dǎo)致腸道黏膜損傷（魏炳棟等，2017）；同時(shí)玉米蛋白粉中的某些致敏原能與小腸壁上皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，誘導(dǎo)腸黏膜發(fā)生炎癥（華雪銘等，2012），這可能是導(dǎo)致本試驗(yàn)中黃顙魚腸道組織結(jié)構(gòu)損傷的主要原因。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.2%～0.8%丁酸鈉后腸道肌層厚度和皺襞高度顯著升高，腸道組織形態(tài)有明顯的改善。研究表明，丁酸鈉所含丁酸可為腸道細(xì)胞補(bǔ)充能量，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖發(fā)育（Canani等，2012），誘導(dǎo)腸道細(xì)胞 mRNA 和蛋白質(zhì)的合成，有利于腸絨毛增殖 （華雪銘等，2012），顯著提高腸黏膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的mRNA水平，有助于黏膜的損傷修復(fù)（Ma等，2012）；誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞表面黏液層的黏蛋白MUC2基因表達(dá)，黏蛋白合成增加，對黏膜層具有保護(hù)作用（Bai等，2010）。 Wu 等（2020）在黃姑魚上的研究表明，飼料中添加0.15%丁酸鈉能有效改善低魚粉組黃姑魚腸道的肌層厚度和皺襞高度，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，在飼料中添加0.2%丁酸鈉可提高攝食低魚粉飼料黃顙魚的生長性能和飼料利用率，改善腸道組織形態(tài)。