趙國婧，謝國陽，肖芳斌，姜華祥，許恒毅*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，330047，南昌；2.南昌市青云譜區(qū)市場和質(zhì)量監(jiān)督管理局個體私營經(jīng)濟協(xié)會辦公室，330001，南昌；3.南昌市青云譜區(qū)檢驗檢測中心，330001，南昌)

0 引言

乳制品營養(yǎng)豐富，是人類膳食中蛋白質(zhì)、鈣、磷、維生素A和維生素B2的重要來源。最近幾年，隨著國民經(jīng)濟水平的持續(xù)進步，我國人民的生活質(zhì)量逐步提高，國內(nèi)的家庭膳食層次已經(jīng)普遍地改善了，對于乳制品消費水平呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。目前普遍的乳類品種主要包含液態(tài)乳、粉態(tài)乳和其他種類乳制品。由于乳制品營養(yǎng)豐富，極易被微生物污染，成為其生長繁殖的營養(yǎng)介質(zhì)。在所有發(fā)生的大規(guī)模乳制品安全事件中，大部分是由致病菌污染所引起的乳制品中毒事件。乳制品污染后的食源性致病菌主要包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和克羅諾桿菌等，金黃色葡萄球菌，因其廣泛存在于自然界中，可以通過乳制品加工人員、加工過程、運輸過程等途徑污染乳制品，造成乳制品腐敗變質(zhì)；沙門氏菌是一種引起細菌性食物中毒的重要致病菌，生鮮乳中少量的沙門氏菌就可能導(dǎo)致感染，引發(fā)沙門氏菌病等；克羅諾桿菌又稱阪崎腸桿菌，是奶粉中最常見的食源性致病菌，嬰幼兒是該菌感染的高危人群且感染后致死率較高，因此對其預(yù)防和檢測尤為重要。本文介紹了常見致病菌的檢測方法，并重點介紹了基于核酸的檢測方法，以期為乳制品中食源性致病菌的檢測提供參考。表1總結(jié)了不同的檢測方法在致病菌分析測定中的應(yīng)用。

表1 不同的檢測方法在致病菌分析測定中的應(yīng)用

1 基于培養(yǎng)的檢測方法

目前國家標準對于乳制品檢測有詳細的檢驗方法和限定范圍，如GB 4789.18—2010《乳與乳制品檢驗》[1]、GB 4789.4—2010《沙門氏菌檢驗》[2]、GB 4789.10—2016《金黃色葡萄球菌檢驗》[3]、GB 4789.40—2010《阪崎腸桿菌檢驗》[4]等。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度以及培養(yǎng)時間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，這些特征包括菌落的形狀、顏色等方面，因此可以通過觀察菌落的形態(tài)特征對微生物種類進行判斷。這些基于細菌培養(yǎng)的檢測方法都可以從樣品中得到致病菌定性和定量的檢驗結(jié)果，但都需要經(jīng)過樣品處理、增菌、分離、生化鑒定等過程，具有操作簡單、成本低、準確度高等優(yōu)點，卻也存在周期長、操作復(fù)雜、鑒定微生物種類有限等缺點，難以滿足市場需求。因此出現(xiàn)了一些特異性更好、檢測更快速靈敏的致病菌檢測技術(shù)。

2 基于分子生物學(xué)技術(shù)的檢測方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有多種核酸檢測方法應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。如經(jīng)典的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR，Polymerase chain reaction)，該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強的特點。Rahn[6]等根據(jù)沙門氏菌的侵襲蛋白A(invasion protein A，invA)基因設(shè)計引物,用PCR技術(shù)對沙門氏菌進行了檢測，共檢測了630株沙門氏菌和21個屬的142株非沙門氏菌，準確率為99.4%。但PCR技術(shù)需要核酸擴增儀作為輔助工具，對操作人員技術(shù)水平要求較高，因而在實驗室之外的應(yīng)用有一定局限。近年來核酸等溫擴增技術(shù)逐步發(fā)展，以環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)、重組酶等溫核酸擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)、重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴增(Recombinase Aided Amplification，RAA)、依賴核酸序列的擴增(Nuclear Acid Sequence-based Amplification，NASBA)為主的一類核酸技術(shù)逐漸應(yīng)用于食源性致病菌的檢測，同樣具備一定的應(yīng)用前景。

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)是一種目前較新的DNA擴增方法，其可以針對靶基因上的特異性區(qū)域設(shè)計引物，從而利用Bst DNA聚合酶在恒溫條件下完成對靶基因的大量擴增，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，但也容易污染，出現(xiàn)假陽性問題。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細菌類病原微生物檢測、病毒類病原微生物檢測、病原寄生蟲檢測、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測等領(lǐng)域。關(guān)玉婷[7]等以沙門氏菌腸毒素stn基因為靶基因設(shè)計引物，應(yīng)用DNA聚合酶鏈置換活性和羥基萘酚藍(HNB)在LAMP反應(yīng)中顏色變化特征，建立了可視化LAMP檢測技術(shù)，其靈敏度可達1.55×10-8ng/μL，實現(xiàn)了原料乳中沙門氏菌的檢測。林芳明[8]等發(fā)明了不耐熱型產(chǎn)腸毒素，即大腸埃希菌的LAMP快速檢測方法，結(jié)果顯示，此方法能夠準確地從生鮮牛乳中檢測到1 pg當量的產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的DNA，且與其他類型的大腸埃希菌及細菌不發(fā)生交叉反應(yīng)，檢測所需時間約1 h，具有特異性強、敏感性高、快速的特點，對保障生鮮牛乳食品安全有十分重要的意義。程曉艷[9]等根據(jù)副溶血弧菌的毒力基因tdh保守序列設(shè)計引物，建立了LAMP快速檢測技術(shù)，結(jié)果表明，該細菌的DNA最低的檢出限是35.5 fg/反應(yīng)管，該方法的靈敏度比PCR高10倍，只需約45 min左右完成。同時利用此方法對扇貝樣品中的副溶血弧菌進行檢測，結(jié)果顯示，此LAMP方法對檢測致病性的副溶血弧菌安全、可靠。

2.2 重組酶等溫核酸擴增技術(shù)

比如重組酶等溫核酸擴增技術(shù)是一種體外恒溫核酸擴增新技術(shù)。該技術(shù)主要模仿T4噬菌體內(nèi)的核酸復(fù)制機制[10]依賴重組酶UvsX[11]與Gp32單鏈結(jié)合蛋白在體外的恒溫環(huán)境下實現(xiàn)DNA模板特異性結(jié)合和識別，同時通過鏈置換DNA聚合酶Bsu實現(xiàn)了模板DNA的擴增。此方法檢測優(yōu)點是時間短、操作方便、靈敏程度高，缺點是該技術(shù)對某些特定的短序列核酸無法檢測。該技術(shù)在食源性病毒、食源性致病菌、動物源性成分檢測等方面均有廣泛應(yīng)用。高建欣[12]等建立了一種RPA與乳膠微球試紙條(Latex Microsphere Test Strips，LMTS)相結(jié)合的方法，根據(jù)金黃色葡萄球菌的基因nuc保守區(qū)序列設(shè)計特異性的引物，經(jīng)過RPA的擴增，完成了金黃色葡萄球菌快速檢測，其靈敏度為1.2×102CFU/mL。劉立兵[13]等依照志賀氏菌侵襲性質(zhì)的?？乖璈基因(ipaH)保守區(qū)序列的設(shè)計和exo探針，建立了志賀氏菌實時熒光重組酶聚合酶擴增技術(shù)的檢測方法。該方法特異性擴增志賀氏菌，在39 ℃恒溫下20 min即可完成檢測，檢測的靈敏度為3.5×10-3ng/μL，該方法在人工污染樣本中的檢測時間僅需7—12 min。GAO[14]等建立了一種快速檢測沙門氏菌的RPA-LFD檢測方法，在30～45 ℃下，只需要8 min的擴增就可達到相關(guān)擴增子的檢測閥值，該方法特異性強并且靈敏度高。RPA技術(shù)可以為食源性的致病菌檢測提供一類快速且簡便的方案。

2.3 重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴增技術(shù)

重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴增技術(shù)也是一種恒溫擴增方法，與RPA不同的是，RAA擴增法利用的是從細菌或真菌中獲得的重組酶，在37 ℃的恒溫環(huán)境下，該重組酶可以和引物的DNA緊密結(jié)合，形成酶與引物的復(fù)合體，當引物不斷在模板的DNA上搜尋到和它完全互補的序列時，并且在單鏈DNA的結(jié)合蛋白輔助下，展開模板DNA的內(nèi)部雙鏈結(jié)構(gòu)同時使引物和模板相配對，隨后在DNA的聚合酶作用下，組成了新的DNA互補鏈，擴增產(chǎn)物以指數(shù)級增長。該技術(shù)用時少，操作簡單，已廣泛應(yīng)用于微生物檢測、醫(yī)學(xué)檢測等領(lǐng)域。張小平[15]等人按照沙門菌的invA基因來設(shè)計引物與探針，并且采用重組酶介導(dǎo)核酸擴增方法對沙門菌進行快速檢測。結(jié)果顯示，建立的方法在39 ℃下進行，檢測時間在20 min以內(nèi)，檢測下限為102copies/μL。魏瑩[16]等建立了RAA技術(shù)用于溶血性鏈球菌的檢測，檢測時間小于20 min，靈敏度為10 copies/μL，具有良好的特異性。

2.4 依賴核酸序列的擴增技術(shù)

依靠核酸相關(guān)序列的擴增技術(shù)是一類擴增RNA的新技術(shù)種類，依靠一對特異性引物來介導(dǎo)的，并且以3種酶來催化的，以單鏈RNA為模板等溫擴增[17]。該技術(shù)具有操作簡單、靈敏程度高、特異性較強的特點，已廣泛應(yīng)用于多種病毒的檢測當中，但仍然還存在假陽性、靈敏度低等問題，需要進一步優(yōu)化改進反應(yīng)條件。楊蜜[18]等人設(shè)計了一對具有隱球類菌屬特異性的引物，并且建立了NASBA擴增隱球菌的RNA方法，結(jié)果表明該方法靈敏度可達10 CFU/mL。鐘響[19]等人按照金黃色葡萄球菌的核酸酶nuc1基因設(shè)計相關(guān)的引物，進行了NASBA檢測，同時采用了人工添加菌來污染樣品進行驗證。結(jié)果顯示，實驗中未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，靈敏度高，檢出限達到4 pg/μL的總RNA；檢測時間短，24 h即可完成樣品中目標菌的篩選，非常適合口岸快速檢出金黃色葡萄球菌。

2.5 核酸交聯(lián)染料相結(jié)合等溫擴增技術(shù)

等溫擴增技術(shù)來檢測乳制品中致病菌方法是具有靈敏度高、特異性強、快速便捷等優(yōu)點的方案，已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。然而，細胞死亡后，由于DNA分子能保留較長時間，從樣品中提取的死菌DNA同樣能作為模板進行特異性擴增，因此檢測過程中難以區(qū)分“死菌”和“活菌”容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[20]。核酸交聯(lián)染料即含有2個或2個以上烷基化官能基團的烷基化試劑，核酸染料可以通過受損的死菌細胞膜，在特定光激活后與DNA結(jié)合，從而抑制DNA擴增，這樣可以消除死菌的影響。GAO[21]等食品中的活的但不可培養(yǎng)的副溶血性弧菌(VBNC)進行檢測時發(fā)現(xiàn)：當VBNC菌濃度小于104CFU/g時，PMAxx處理樣品后結(jié)合qLAMP法與qPCR比檢測結(jié)果更精確。減少了普通核酸檢測在食品中VBNC微生物含量低的情況下，可能導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。

3 基于免疫學(xué)技術(shù)的檢測方法

在1959年，研究者yalow和Berson同時將發(fā)射性同位素示蹤方法和免疫反應(yīng)相結(jié)合創(chuàng)建了現(xiàn)代的發(fā)射免疫測定法，從而開創(chuàng)了免疫分析這一嶄新領(lǐng)域，免疫學(xué)技術(shù)發(fā)展至今，具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強等特點[22]，已經(jīng)在微生物相關(guān)的檢測方面取得了廣泛的應(yīng)用。免疫學(xué)技術(shù)的主要原理是抗原與相應(yīng)抗體，無論在體內(nèi)或體外相遇，均可以發(fā)生各種抗原抗體反應(yīng)，包括中和反應(yīng)、沉淀反應(yīng)或溶解反應(yīng)等，由于特定抗原(抗體)的量與反應(yīng)的強度呈現(xiàn)明顯的函數(shù)關(guān)系，可以依此對樣品進行定性或定量的分析，主要包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)等。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)的基本原理是將可溶性抗原或抗體吸附到某種固定載體表面，采用添加酶標的抗體或抗原，產(chǎn)生抗原和抗體反應(yīng)，從而形成抗原抗體的復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后，游離的酶標抗體和抗原被沖洗掉，然后再加入酶底物和載體上的抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合進行免疫酶染色，通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量就可確定樣品中的待測物質(zhì)含量。周鶴峰[23]等構(gòu)建了阪崎腸桿菌的特異性抗體相關(guān)間接ELISA檢測方法，最后確定37 ℃顯色10 min，檢測靈敏度達到102CFU/mL，該檢測方法具有高效快速、特異性強等特點，為食品中的阪崎腸桿菌的相關(guān)檢測創(chuàng)立了研究基礎(chǔ)。胡金強[24]等人選用金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶nuc基因作為靶標，采用地高辛來標記引物擴增的PCR產(chǎn)物和用生物素標記的探針進行雜交，然后與ELISA平板上的鏈霉素雜交，通過抗地高辛抗體顯色建立PCR-ELISA檢測技術(shù)，應(yīng)用結(jié)果表明采用PCR-ELISA技術(shù)來檢測人工污染金黃色葡萄球菌的牛奶檢測敏感性為101CFU/mL，比普通PCR檢測的敏感性(103CFU/mL)高100倍，實驗全過程只需要5—6 h。該研究建立的PCR-ELISA方法具有良好的特異性與敏感性，能夠特異、敏感、準確地檢測牛奶的金黃色葡萄球菌。

3.2 酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)

酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)ELFIA(Enzyme-Linked Fluorescent Immunoassay)是在酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展創(chuàng)立的用酶系統(tǒng)和熒光免疫分析相互結(jié)合的微生物的快速檢測方法。它利用理想的熒光底物來代替顯色底物，使得分析靈敏度顯著提高，從而達到擴大測量范圍和減少試劑用量的目的。劉新亮[25]等通過以下3個步驟完成沙門氏菌的快速檢測：首先采用全自動熒光酶免疫分析儀(mini VIDAS)來進行初篩，隨后采用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基來復(fù)篩，最后采用全自動的微生物鑒定儀(VITEK 2 Compact)來進行陽性菌株的生化性狀的鑒定。該聯(lián)用法初篩時能在45 min之內(nèi)準確鑒定出陽性菌株，陽性菌株經(jīng)沙門氏菌顯色培養(yǎng)基分離純化后按照VITEK檢測的結(jié)果與血清學(xué)凝集試驗結(jié)果相結(jié)合即可以判斷它是否屬于沙門氏菌。采用該方法對395種食品和水產(chǎn)品中的目標菌同時檢測的結(jié)果與國標法完全一致，其準確性好，并且還具有快捷高效、自動化程度高的特點。

4 結(jié)束語

傳統(tǒng)國標法檢測乳制品中的相關(guān)致病菌具有特異性差、操作繁瑣、效率低等不足，很難實現(xiàn)快速有效的檢測。免疫學(xué)方法存在靈敏度低、對抗體依賴、價格高昂等缺點，而分子生物學(xué)，由于特異性強靈敏度高，逐漸應(yīng)用于致病菌的快速檢測，但其也存在以下不足需要改進：1)需要購買昂貴的儀器設(shè)備；2)等溫核酸擴增技術(shù)適用于現(xiàn)場做大量樣品的快速檢測，反應(yīng)簡單，但存在易產(chǎn)生假陽性和假陰性的缺點；3)新開發(fā)的PMAxx-RAA方法實現(xiàn)了在死菌存在的環(huán)境下檢測出活的致病菌，避免了常規(guī)分子生物學(xué)方法的缺點。在今后的研究中對于等溫核酸擴增技術(shù)存在假陽性、假陰性等問題，需要進一步加強對此技術(shù)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，相信RAA技術(shù)能利用其優(yōu)勢，成為乳制品中致病菌檢測的重要方法。